1. Početno razumijevanje

U ovoj fazi moramo razumjeti neke koncepte i terminologiju, kako ne bismo pravili greške pred našim starijima, kao što su:

P: Koja je razlika između RT-PCR, qPCR, PCR u realnom vremenu i RT-PCR u realnom vremenu?

Odgovor: RT-PCR je PCR sa reverznom transkripcijom(reverzna transkripcija PCR, RT-PCR), koja je široko korištena varijanta polimerazne lančane reakcije (PCR).U RT-PCR, RNA lanac se reverzno transkribuje u komplementarnu DNK, koja se zatim koristi kao šablon za amplifikaciju DNK pomoću PCR-a.
Real-time-PCR i qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) su ista stvar, oba su kvantitativni PCR u realnom vremenu, što znači da svaki ciklus PCR-a ima zapise podataka u realnom vremenu, tako da se broj početnih šablona može podesiti preciznom analizom.

Iako se čini da su i PCR u realnom vremenu (fluorescentni kvantitativni PCR u realnom vremenu) i PCR s reverznom transkripcijom (reverzna transkripcija PCR) skraćeno RT-PCR, međunarodna konvencija glasi: RT-PCR se posebno odnosi na reverznu transkripcijuPCR , PCR u realnom vremenu općenito je skraćeno qPCR (kvantitativni PCR u realnom vremenu).

I RT-PCR u realnom vremenu (RT-qPCR), to je PCR reverzne transkripcije u kombinaciji sa fluorescentnom kvantitativnom tehnologijom: prvo nabavite cDNK (RT) iz RNA reverzne transkripcije, a zatim koristite PCR u realnom vremenu za kvantitativnu analizu (qPCR).Većina laboratorija radi RT-qPCR, odnosno istražuje regulaciju ekspresije RNK na niže, tako da se qPCR o kojem svi govore u laboratoriji zapravo odnosi na RT-qPCR, ali ne zaboravite da još uvijek postoji mnogo DNK testova u kliničkim primjenama.Kvantitativna analiza, kao što je otkrivanje HBV virusa hepatitisa B.

Pitanje: Nakon čitanja puno fluorescentnog kvantitativnog PCR-a, zašto bi amplificirani fragment trebao biti kontroliran u rasponu od 80-300bp?

Odgovori: Dužina svake sekvence gena je različita, neke su nekoliko kb, neke stotine bp, ali samo trebamo zahtijevati da dužina proizvoda bude 80-300bp kada dizajniramo prajmere, prekratki ili predugački nisu prikladni za fluorescentnu kvantitativnu PCR detekciju.Fragment proizvoda je prekratak da bi se mogao razlikovati od prajmera-dimera.Dužina prajmera-dimera je oko 30-40bp, i teško je razlučiti da li je prajmer-dimer ili proizvod ako je manji od 80bp.Ako je fragment proizvoda predugačak i prelazi 300 bp, to će lako dovesti do niske efikasnosti amplifikacije i neće moći efikasno otkriti količinu gena.

Na primjer, kada brojite koliko je ljudi u učionici, trebate samo izbrojati koliko ima usta.Isto važi i kada detektujete gene, potrebno je samo da detektujete određenu sekvencu gena da biste predstavili ceo niz.Ako želite da brojite ljude, morate brojati i usta i nos, uši i naočare, a lako je pogriješiti.

Da proširimo, u biološkim istraživanjima postoji mnogo istraživačkih slučajeva od tačke do područja, jer je sekvenca gena bilo koje vrste jako duga, nepotrebno je i nemoguće izmjeriti sve fragmente, kao što je bakterijsko 16S sekvenciranje, što je da se izvrši konzervativni slijed bakterijskih testova kako bi se zaključio broj određene populacije bakterija.

P: Koja je optimalna dužina za qPCR dizajn prajmera?

Odgovori: Uopšteno govoreći, dužina prajmera je oko 20-24bp, što je bolje.Naravno, prilikom projektovanja prajmera moramo obratiti pažnju na vrednost TM prajmera, jer se to odnosi na optimalnu temperaturu žarenja.Nakon mnogo eksperimenata, dokazano je da je 60°C bolja TM vrijednost.Ako je temperatura žarenja preniska, to će lako dovesti do nespecifičnog pojačanja.Ako je temperatura žarenja previsoka, efikasnost amplifikacije će biti relativno niska, vrhunac krivulje pojačanja će početi kasnije, a CT vrijednost će biti odgođena.

P: Kako se metoda bojenja razlikuje od metode sonde?

Odgovor: Metoda bojenjaNeke fluorescentne boje, kao što su SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, itd., ne emituju svjetlost same po sebi, ali će emitovati fluorescenciju nakon vezivanja za manji žljeb dvolančane DNK.Stoga, na početku PCR reakcije, mašina ne može detektovati fluorescentni signal.Kada reakcija dostigne fazu žarenja-ekstenzije, otvara se dvostruki lanac i sintetizira se novi lanac pod djelovanjem DNK polimeraze, a fluorescentni molekul se veže za manji žljeb dsDNA.Kako se broj PCR ciklusa povećava, sve više i više boja se kombinuje sa dvolančanom DNK, a fluorescentni signal se takođe kontinuirano pojačava.Metoda bojenja se uglavnom koristi u naučnim istraživanjima.
PS: Budite oprezni kada radite eksperiment, boja mora biti u kombinaciji sa ljudskim DNK, pazite da je pretvorite u fluorescentnu osobu.

Metoda bojenja (lijevo) Metoda sonde (desno)
PS: Budite oprezni kada radite eksperiment, boja mora biti u kombinaciji sa ljudskim DNK, pazite da je pretvorite u fluorescentnu osobu.

SYBR Green Ⅰ se vezuje za manji žleb DNK

Metoda sondeTaqman sonda je najčešće korištena sonda za hidrolizu.Na 5′ kraju sonde nalazi se fluorescentna grupa, obično FAM, a sama sonda je sekvenca komplementarna ciljnom genu.Na kraju 3′ nalazi se fluorescentna grupa za gašenje.Prema principu prijenosa energije fluorescentne rezonance (Förster rezonantni prijenos energije, FRET), kada su reporterska fluorescentna grupa (donorska fluorescentna molekula) i gaseća fluorescentna grupa (akceptorska fluorescentna molekula) pobuđene. ce molekula akceptora, dok je autofluorescencija oslabljena.Stoga, na početku PCR reakcije, kada je sonda slobodna i netaknuta u sistemu, reporterska fluorescentna grupa neće emitovati fluorescenciju.Prilikom žarenja, prajmer i sonda se vezuju za šablon.Tokom faze ekstenzije, polimeraza kontinuirano sintetiše nove lance.DNK polimeraza ima aktivnost 5′-3′ egzonukleaze.Kada stigne do sonde, DNK polimeraza će hidrolizirati sondu iz šablona, ​​odvojiti reportersku fluorescentnu grupu od fluorescentne grupe gasitelja i osloboditi fluorescentni signal.Pošto postoji odnos jedan-na-jedan između sonde i šablona, ​​metoda sonde je superiornija od metode bojenja u smislu tačnosti i osjetljivosti testa.Metoda sonde se uglavnom koristi u dijagnostici.

P: Šta je apsolutna kvantifikacija?Šta je relativna kvantifikacija?

Odgovori: Apsolutna kvantifikacija odnosi se na izračunavanje početnog broja kopija uzorka koji se testira qPCR-om, kao što je koliko HBV virusa ima u 1 ml krvi.Rezultat dobijen relativnom kvantifikacijom je promjena u količini ciljnog gena u specifičnom uzorku u odnosu na drugi referentni uzorak, a ekspresija gena je regulirana naviše ili naniže.

P: Hoće li količina ekstrakcije RNK, efikasnost reverzne transkripcije i efikasnost amplifikacije uticati na eksperimentalne rezultate?
P: Hoće li skladištenje uzoraka, reagensi za ekstrakciju, reagensi za reverznu transkripciju i potrošni materijali koji prenose svjetlost utjecati na eksperimentalne rezultate?
P: Koja metoda može ispraviti eksperimentalne podatke?

Što se tiče ovih problema, detaljno ćemo ih opisati u naprednim i naprednim odjeljcima u nastavku.
2. Napredna znanja

Što se tiče fluorescentne kvantitativne PCR u realnom vremenu, moramo prepoznati realnost da se svake godine objavljuje na hiljade naučno-istraživačkih radova, među kojima nije mali broj fluorescentna kvantitativna PCR tehnologija.

Ako ne postoji zajednički standard za mjerenje fluorescentnog kvantitativnog PCR eksperimenta, rezultati mogu značajno varirati.Za isti gen iste vrste, uz istu metodu obrade, rezultati detekcije će se također uvelike razlikovati, a kasnijima će biti teško ponoviti iste rezultate.Vi Niko ne zna šta je ispravno, a šta pogrešno.

Da li to znači da je fluorescentni kvantitativni PCR tehnologija varanja ili nepouzdana tehnologija?Ne, to je zato što je fluorescentni kvantitativni PCR osjetljiviji i precizniji, a malo pogrešna operacija će proizvesti potpuno suprotne rezultate.Mali gubitak je hiljadu milja daleko.Autora članka recenzenti mogu više puta mučiti.Istovremeno, recenzente časopisa je teško izabrati između različitih eksperimentalnih rezultata.

Sve u svemu, ukazuje na nedostatak konsenzusa u PCR eksperimentima u realnom vremenu.U tu svrhu, viši naučnici u industriji počeli su da formulišu standarde,zahtijevajući od saradnika da navedu neke neophodne eksperimentalne detalje i detalje obrade podataka (uključujući potrebne podatke) u članku kako bi se ispunili ovi standardi.

Recenzenti mogu procijeniti kvalitet eksperimenta čitajući ove detalje;budući čitaoci mogu ovo koristiti i za ponavljanje eksperimenta ili poboljšanje eksperimenta.Tada su eksperimentalni rezultati dobijeni na ovaj način puni informacija, kvalitetni i upotrebljivi.

MIBBI (minimalne informacije za biološka i biomedicinska ispitivanja -http://www.mibbi.org) je nastao.MIBBI je projekat koji pruža standarde za eksperimente.Objavljuje se u prirodi.Ovaj projekat je usmjeren na različite biološke eksperimente, uključujući ćelijsku biologiju, Microarray, qPCR o čemu ćemo sada razgovarati, itd., i predviđa svaku vrstu eksperimenta prilikom slanja rukopisa.Te informacije treba dati u svakom trenutku.

U MIBBI projektu postoje dva članka vezana za fluorescentni kvantitativni PCR, tj.:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – strukturirani jezik i vodič za izvještavanje za kvantitativne PCR podatke u realnom vremenu;
·MIQE (Minimalne informacije za objavljivanje kvantitativnih PCR eksperimenata u realnom vremenu) – minimalne informacije za objavljivanje članaka o kvantitativnim PCR eksperimentima u realnom vremenu.
Prvo, hajde da pričamo o RDML-u, specifikaciji terminologije.

Ako ne postoji standardna definicija za sve, nemoguće je nastaviti diskusiju, zbog čega je objašnjenje pojmova toliko važno na ispitu.
Terminologija korištena u fluorescentnom kvantitativnom PCR eksperimentu uključuje sljedeći sadržaj.QIAGEN je napravio najbolji sažetak za nas.Sljedeće su sve suverobe .

Kriva pojačanja
Kriva amplifikacije se odnosi na krivu napravljenu tokom PCR procesa, sa brojem ciklusa na apscisi i intenzitetom fluorescencije u realnom vremenu tokom reakcije kao ordinatom.

Odlična kriva pojačanja treba imati sljedeće karakteristike: osnovna linija je ravna ili blago smanjena i nema očitog uzlaznog trenda;tačka pregiba krive je jasna, a nagib eksponencijalne faze je proporcionalan efikasnosti amplifikacije.Što je veći nagib, to je veća efikasnost pojačanja;ukupna kriva pojačanja Paralelizam je dobar, što ukazuje da je efikasnost pojačanja svake cijevi slična;eksponencijalna faza krivulje amplifikacije uzoraka niske koncentracije je očigledna.

Polazno (osnovno)
Osnovna linija je nivo buke ranog ciklusa, obično se mjeri između 3. i 15. ciklusa, jer se povećanje vrijednosti fluorescencije uzrokovano proizvodom amplifikacije ne može otkriti tokom ovog perioda.Broj ciklusa koji se koristi za izračunavanje osnovne linije može varirati i možda će biti potrebno smanjiti ako se koriste velike količine šablona ili ako je nivo ekspresije ciljnog gena visok.

Postavljanje osnovne linije zahtijeva pregled podataka o fluorescenciji iz krivulje linearnog pojačanja.Osnovna linija je postavljena tako da rast krivulje pojačanja počinje s brojem ciklusa većim od najvećeg broja osnovnog ciklusa.Polazne linije se moraju postaviti pojedinačno za svaku ciljnu sekvencu.Prosječne vrijednosti fluorescencije otkrivene u ranim ciklusima treba oduzeti od vrijednosti fluorescencije dobijenih u pojačanim proizvodima.Najnovije verzije različitog softvera za PCR u realnom vremenu omogućavaju automatsku optimizaciju osnovnih postavki za pojedinačne uzorke.

Tokom prvih nekoliko ciklusa reakcije PCR amplifikacije, signal fluorescencije se ne mijenja mnogo.Približavanje pravoj liniji naziva se bazna linija, ali ako pažljivo pogledamo prvih nekoliko ciklusa, vidimo da se unutar osnovne linije dešava ono što se dešava na slici ispod.

Pozadina Pozadina se odnosi na
vrijednost nespecifične fluorescencije u reakciji.Na primjer: neefikasno gašenje fluorescencije;ili veliki broj dvolančanih DNK šablona zbog upotrebe SYBR Green.Pozadinske komponente signala se matematički uklanjaju softverskim algoritmom za PCR u realnom vremenu.

Signal reportera
Reporterski signal se odnosi na fluorescentni signal koji generiše SYBR Green ili fluorescentno obeležene sonde specifične za sekvencu tokom PCR u realnom vremenu.

Normalizirani reporterski signal (RN)
RN se odnosi na intenzitet fluorescencije reporterske boje podijeljen sa intenzitetom fluorescencije pasivne referentne boje izmjerenim u svakom ciklusu.

Pasivna referentna boja
U nekim PCR-ovima u realnom vremenu,fluorescentna boja ROX se koristi kao interna referenca za normalizaciju fluorescentnog signala.Ispravlja varijacije zbog nepreciznog pipetiranja, položaja jažice i fluktuacija fluorescencije na osnovi svake jažice.

Prag fluorescencije (prag)
je podešen iznad pozadinske vrijednosti i značajno ispod vrijednosti platoa krivulje pojačanja.Mora ležati u linearnom području krivulje amplifikacije, što predstavlja log-linearni opseg detekcije PCR-a.Pragovi bi trebali biti postavljeni u prikazu krivulje logaritamske amplifikacije tako da se log-linearna faza PCR-a lako može identificirati.Ako postoji više ciljnih gena u PCR-u u realnom vremenu, prag mora biti postavljen za svaku metu.Generalno, signal fluorescencije prvih 15 ciklusa PCR reakcije se koristi kao pozadinski signal fluorescencije, a prag fluorescencije je 10 puta veći od standardne devijacije signala fluorescencije prvih 3 do 15 ciklusa PCR, a prag fluorescencije je postavljen u fazi PCR amplifikacije.Općenito, svaki instrument ima svoj prag fluorescencije postavljen prije upotrebe.

Prag ciklusa (CT) ili prelazna tačka (CP)
Ciklus u kojem kriva amplifikacije prelazi prag (tj. tačka u kojoj se detekcija fluorescencije značajno povećava).CT može biti razlomak i količina početnog šablona se može izračunati.CT vrijednost predstavlja broj doživljenih ciklusa kada fluorescentni signal u svakoj PCR reakcijskoj cijevi dostigne postavljeni prag.Postoji linearni odnos između CT vrijednosti svakog predloška i logaritma početnog broja kopije predloška, ​​tj.veći je početni broj kopije, manja je CT vrijednost i obrnuto.Standardna kriva se može napraviti korištenjem standarda sa poznatim početnim brojem kopije, pri čemu apscisa predstavlja CT vrijednost, a ordinata predstavlja logaritam početnog broja kopije.Stoga, sve dok se dobije CT vrijednost nepoznatog uzorka, početni broj kopija uzorka može se izračunati iz standardne krive.

ΔCT vrijednost
ΔCT vrijednost opisujerazlika između ciljnog gena i odgovarajuće CT vrijednosti endogenog referentnog gena, kao što je gen za održavanje kućanstva, i koristi se za normalizaciju količine korištenog šablona:
⇒ΔCT = CT (ciljani gen) – CT (endogeni referentni gen)

ΔΔCT vrijednost
ΔΔCT vrijednost opisuje razliku između srednje vrijednosti ΔΔCT uzorka od interesa (npr. stimulirane ćelije) i srednje vrijednosti ΔΔCT referentnog uzorka (npr. nestimulirane ćelije).Referentni uzorak se također naziva kalibracijskim uzorkom i svi ostali uzorci su normalizirani na ovo za relativnu kvantifikaciju:
⇒ΔΔCT = prosječan ΔCT (uzorak od interesa) – prosječan ΔCT (referentni uzorak)

Endogeni referentni geni (endogeni referentni geni)
Nivoi ekspresije endogenih referentnih gena, kao što su geni za održavanje (domaćinski geni), ne razlikuju se između uzoraka.Poređenje CT vrijednosti referentnog gena sa ciljnim genom omogućava da se nivo ekspresije ciljnog gena normalizira na količinu ulazne RNK ili cDNK (pogledajte odjeljak o ΔCT vrijednostima iznad).

Interni referentni geni ispravni zamoguća degradacija RNK ili prisustvo inhibitora enzima u uzorcima RNK, kao i varijacije u sadržaju RNK, efikasnost reverzne transkripcije, oporavak nukleinske kiseline i rukovanje uzorkom.Da bismo odabrali optimalni referentni gen(e), modificirali smo algoritam kako bismo omogućili njegov odabir optimalne reference ovisno o eksperimentalnoj postavci.

Unutrašnja kontrola
Kontrolna sekvenca koja je amplificirana u istoj reakciji kao i ciljna sekvenca i ispitana drugom sondom (tj. izvođenjem dupleks PCR).Interne kontrole se često koriste da bi se isključila neuspjela pojačanja, kao što je kada ciljna sekvenca nije otkrivena.
Uzorak kalibracije
Referentni uzorak (na primjer, prečišćena RNK iz ćelijske linije ili tkiva) korišten u relativnoj kvantifikaciji za poređenje svih drugih uzoraka kako bi se odredio relativni nivo ekspresije gena.Uzorak za kalibraciju može biti bilo koji uzorak, ali je obično kontrolni (na primjer, neobrađeni uzorak ili uzorak iz nulte vremena eksperimenta).

Pozitivne kontrole
koristite kontrolne reakcije sapoznate količine šablona.Pozitivne kontrole se često koriste za provjeru da li set prajmera ili set prajmera-sonde radi ispravno i da je reakcija pravilno postavljena.

Bez kontrole šablona (NTC)
Kontrolna reakcija koja sadrži sve potrebne komponente reakcije amplifikacije osim šablona, ​​koji se obično zamjenjuje vodom.Korištenjem NTC-a može se pronaći kontaminacija uzrokovana kontaminacijom reagensom ili stranom DNK, čime se osigurava autentičnost i pouzdanost podataka detekcije.Pojačavanje NTC kontrole ukazuje na kontaminaciju.

Nema RT kontrole (NRT)
Proces ekstrakcije RNK može sadržavati rezidualnu genomsku DNK, koja je izuzetno štetna i krivac je za kvalitet podataka i prirodni neprijatelj qPCR-a, tako da kada se osmišljavaju eksperimenti, on mora biti dizajniran da samo pojača detekciju RNK.Postoje dva načina, jedan je dizajniranje prajmera preko introna, drugi je potpuno uklanjanje DNK, koji je bolji, o čemu će biti riječi kasnije.NTR kontrola je čarobno ogledalo za otkrivanje zagađenja DNK.Ako postoji pojačanje, to znači da postoji zagađenje.

Standardi
Standardi su uzorci poznate koncentracije ili broja kopija koji se koriste za konstruiranje standardne krive.Da bi se osigurala stabilnost standarda, fragment gena se obično klonira u plazmid i koristi kao standard.

Standardna kriva
obično se razblaži u najmanje 5 gradijenta koncentracije sa standardnim proizvodom prema omjeru udvostručavanja, a 5 tačaka je nacrtano u koordinatama CT vrijednosti i broja kopija, a tačke se povezuju da formiraju liniju za generiranje standardne krive.Za svaku standardnu ​​krivu potrebno je provjeriti njenu valjanost.Vrijednost nagiba je između –3,3 i –3,8, a svaka koncentracija se izvodi u tri primjerka.Poene koje se značajno razlikuju od ostalih bodova treba odbaciti.CT vrijednost uzorka koji se testira se dovodi u standardnu ​​krivu i može se izračunati nivo ekspresije uzorka koji se testira.

CT vrijednost uzorka koji se ispituje dovodi se u standardnu ​​krivu i može se izračunati početni broj kopija uzorka koji se testira.

Efikasnost i nagib
Nagib standardne krive predstavlja efikasnost PCR-a u realnom vremenu.
· Nagib od -3,322 ukazuje da je efikasnost PCR amplifikacije 1, ili 100% efikasna, a količina PCR proizvoda se udvostručuje u svakom ciklusu.
·Nagib manji od –3,322 (npr. –3,8) ukazuje na efikasnost PCR-a
·Nagib veći od –3,322 (npr. –3,0) ukazuje na to da je efikasnost PCR-a veća od 100%, što je zanimljivo, kako bi jedan ciklus PCR-a mogao da generiše više nego duplo više pojačanog proizvoda?Ova situacija se javlja u nelinearnoj fazi PCR reakcije, odnosno postoji velika količina nespecifične amplifikacije.

kriva topljenja
Nakon što je qPCR amplifikacija završena, PCR proizvod se zagrijava.Kako temperatura raste, dvolančani proizvod amplifikacije se postepeno topi, što rezultira smanjenjem intenziteta fluorescencije.Kada se postigne određena temperatura (Tm), veliki broj proizvoda će se otopiti.Fluorescencija naglo opada.Različiti PCR proizvodi imaju različite Tm vrijednosti i različite temperature topljenja, tako da se može identificirati specifičnost PCR-a.

Kriva topljenja (kriva derivacije)
Krivulja topljenja je izvedena da formira mapu pikova, koja može intuitivnije prikazati situaciju fragmenata PCR proizvoda.Budući da je temperatura topljenja Tm vrijednost fragmenta DNK, mogu se procijeniti neki parametri koji utiču na vrijednost Tm fragmenta DNK, kao što su veličina fragmenta, sadržaj GC, itd. Uopšteno govoreći, prema našim principima dizajna prajmera,dužina pojačanog proizvoda je u rasponu od 80-300bp, tako da temperatura topljenja treba da bude između 80°C i 90°C.

Tumačenje krivulje topljenja: Ako se jedini glavni vrh pojavi između 80°C-90°C, to znači da je fluorescentni kvantitativni PCR savršen;ako se glavni vrh pojavi između 80°C-90°C, a razni vrhovi se pojavljuju ispod 80°C, u osnovi se uzima u obzir dimer prajmera.Možete pokušati povećati temperaturu žarenja da biste to riješili;ako se glavni vrh pojavi između 80°C-90°C, a razni vrh se ponovo pojavi kada temperatura poraste, u osnovi se smatra da postoji kontaminacija DNK, te je DNK potrebno ukloniti u početnoj fazi eksperimenta.

Naravno, još uvijek postoje neke abnormalne situacije, koje će biti razložene jednu po jednu u nastavku.
3. Napredna znanja

Da uradim qPCR, moram da kažem MIQE,Minimalne informacijeza objavljivanjeKvantitativnoPCR u realnom vremenuEksperimenti — minimalne informacije za objavljivanje članaka o kvantitativnom PCR-u u realnom vremenueksperimenti.Kako bismo svima pojednostavili razumijevanje, pojednostavit ćemo ključni sadržaj.

Originalni tekst MIQE-a možete pretraživati ​​na Internetu, a najvažnije je da on propisujekontrolna lista podataka koju je potrebno dostaviti prilikom objavljivanja članka .

Recenzenti mogu procijeniti kvalitet eksperimenta čitajući ove detalje;budući čitaoci to također mogu iskoristiti da ponove ili poboljšaju eksperiment.
Vrijedi napomenuti da je na ovoj listi važnost svake liste označena sa E odnosno D.Šta to znači?E: bitne informacije (moraju se dostaviti);D: poželjne informacije (navedite što je više moguće).

MIQE (1)— Eksperimentalni dizajn
Mnogi ološi koji su završili odbranu nakon završenih postdiplomskih studija neće znati kako samostalno osmisliti eksperiment, otvoriti svoje bilježnice i učiniti ono što im učitelj kaže.Kao rezultat toga, eksperimentalni dizajn nije bio rigorozan, a uredništvo časopisa je saopštilo da žele da izmisle ovu i tu sliku, pa su to uradili zabezeknuto.Ovako se prave đubre!

Bliže kući, prvi princip eksperimenta je određivanjestrogost eksperimentalne logike.Najosnovnije je dizajn eksperimenta, a najvažnije kod eksperimentalnog dizajna je kako postaviti ciljni uzorak, referentni uzorak (kontrolu) i broj ponavljanja, tako da eksperimentalni podaci mogu biti referentni, uporedivi i uvjerljivi.

Ciljni uzorakodnosi se na uzorak koji od nas zahtijeva da otkrijemo ciljni gen nakon određenog tretmana.Referentni uzorakje uzorak bez ikakvog tretmana, koji se u biologiji često naziva divljim tipom.

Eksperimentalne replikesu veoma važne.Općenito, broj uvjerljivih ponavljanja mora biti veći od tri.Potrebno je razlikovati šta je biološka, ​​a šta tehnička replikacija.

Biološke replike: Isti verifikacioni eksperiment napravljen sa različitim materijalima (vreme, biljke, serije, reakcione ploče).

Biološko umnožavanje
Uzmimo za primjer tretman bibera pesticidima.Želimo prskati pesticide na tri biljke ABC-a, a zatim tri biljke ABC-a su tri biološke replike, a to su isti verifikacioni eksperiment izveden sa različitim materijalima.Ali kao eksperiment, kontrola je svakako potrebna, tako da možemo prskati jednu od grana biljke A da formiramo eksperimentalnu grupu biljke A, a ne prskati ostale grane biljke A da formiramo kontrolnu grupu.Uradite isto za B i C.

Tehničke kopije (tehničke replike): To je ponovljeni eksperiment osmišljen kako bi se izbjegle greške uzrokovane radom, što je zapravo dupla rupa uključena u isti materijal.I tretmani i kontrole moraju imati postavke repliciranja (minimalno tri) ciljnog gena i internog referentnog gena.

Tehničko ponavljanje
Uzmimo opet za primjer papriku tretiranu pesticidima.Za eksperimentalnu grupu biljke A, napravili smo tri PCR rupe od 1, 2 i 3 za ciljni gen i interni referentni gen, kako bismo uzeli prosjek nakon detekcije.Za kontrolu biljke A grupe se također tretiraju na isti način.Slično, uradite isti tretman za B i C biljke.Ovo je tehničko ponavljanje.

Vrijedi to napomenutiono što ulazi u statistiku je biološko ponavljanje, a tehničko ponavljanje je da se ispita da li postoje slučajni fenomeni u eksperimentalnom procesu, kako bi rezultati eksperimenta bili vjerodostojni, odnosno da bi se izbjegle greške uzimajući njihov prosjek kako to često kažemo.

Negativne kontrole—NTC i NRT
NTC (Kontrola bez predloška), kontrola bez šablona, ​​koristi se za provjeru da li je eksperimentalni materijal kontaminiran.Općenito, voda se koristi kao šablon.Ako postoji fluorescentna reakcija, to ukazuje da je u laboratoriju došlo do kontaminacije nukleinskom kiselinom.

Ova zagađenja dolaze od: nečiste vode, nekvalificiranih reagensa koji sadrže endogenu DNK, zagađenja prajmera, zagađenja laboratorijske opreme, zagađenja aerosolom, itd., potrebno je koristiti čistače RNaze i inhibitore RNaze.Aerosolno zagađenje je najteže pronaći.Zamislite da je vaša laboratorija poput smoga, s raznim nukleinskim kiselinama suspendiranim u zraku.

NRT (bez reverzne transkriptaze), kontrola bez reverzne transkripcije, je nereverzno transkribovana RNK kao negativna kontrola, što je kontrola ostatka gDNK.

Kada se vrši ekspresija gena, količina RNK se detektuje detekcijom količine cDNK nakon reverzne transkripcije.Ako postoji ostatak gDNK kada se RNK pročisti, to će uzrokovati greške u eksperimentalnim rezultatima, jer su stvarni rezultati dobijeni gDNK i cDNK.Na agregatnom nivou, ne samo cDNK, gDNK treba potpuno ukloniti tokom ekstrakcije RNK.

MIQE (2)—uzorak informacija
Takozvana informacija o uzorku znači da kada objavimo članak o qPCR-u, moramo jasno objasniti informacije o uzorku, što je neizostavan dio članka.Slično tome, kada obrađujemo uzorke, također moramo regulirati vlastite operacije kako bismo osigurali valjanost uzoraka.

Opis uzorka je samo rezultat, a više pažnje treba obratiti na materijale uzeti tokom cijelog eksperimenta.

Izbor eksperimentalnih materijala
Uzorci krvi – birajte svježu krv, ne duže od 4 sata.Uzorci ćelija – odaberite prikupljanje svježih ćelija u periodu snažnog rasta.Životinjsko tkivo—Odaberite svježe tkivo koje intenzivno raste.Biljno tkivo – Birajte svježe, mlado tkivo.

Sigurno ste primijetili da u ovih nekoliko rečenica postoji ključna riječ: svježe .
Za gore navedene uzorke, najbolji, isplativ i stabilan komplet na tržištu je Foregeneov kit, koji može brzo i lako izdvojiti njihovu DNK i RNK.

Mini komplet za DNK krvi

Komplet za izolaciju ukupne RNA ćelije

Komplet za izolaciju ukupne RNK životinja

Komplet za izolaciju ukupne RNK biljaka

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Komplet za izolaciju DNK biljaka

Skladištenje eksperimentalnog materijala
Uopšteno govoreći, ne preporučujemo pohranjivanje uzoraka, ako to uslovi dozvoljavaju.Međutim, postoji mnogo prijatelja koji ne mogu provesti eksperimente odmah nakon uzorkovanja, a neki čak moraju nositi spremnike s tekućim dušikom na polje radi uzorkovanja.

Za ovakvog vrijednog prijatelja mogu samo reći da se ne razumiješ u potrošni materijal za reagense.Sada mnoge kompanije za potrošnju reagensa proizvode reagense koji mogu pohraniti uzorke RNK na sobnoj temperaturi, a vi možete odabrati da ih koristite.Konvencionalna metoda skladištenja je skladištenje tečnog azota, korišćenjem malog rezervoara za tečni azot koji se lako prenosi.Nakon što vratite uzorak u laboratoriju, čuvajte ga u frižideru na -80°C.

Za eksperimente koji uključuju RNK, mora se poštovati princip od šest riječi:niska temperatura, bez enzima,ibrzo .

Koncept niske temperature je lako razumljiv;bez enzima, RNaza je svuda u svijetu u kojem živimo (inače bi vas ubio HIV), tako da je kako izbjeći RNazu prilikom izvođenja eksperimenata vrlo važan koncept;brzo,Ne postoji Kung Fu na svijetu koji se ne može slomiti, samo brzina se ne može slomiti.

Stoga, na neki način, što je kraće vrijeme ekstrakcije, to je komplet bolji.ZaštoForegene's kit naglašavaju brzinu, jer to dobro znaju.

PS: Neke cure vrlo pažljivo rade eksperimente, ali nisu tako dobre kao zakucavanje nakon nekoliko godina rada.Oni smatraju da je Bog nepravedan, žale se na druge i traže život.U stvari, ona to nije razumjela.Nije dobro zaštitio RNA, a igrač zakucavanja je bio okretan.Kada je radio eksperiment, mislio je da će završiti zakucavanje sa tri puta, pet puta i dva deljenja, ali je eksperiment dobro odradio.

Bilješka: Sporije, veće šanse za invaziju RNase.Kako se trenirati da budete brzi?Nema šanse, samo vježbajte više.

Za različite eksperimente i različite uzorke ipak je potrebno pročitati više literature i odabrati odgovarajuću metodu obrade.Za proces prikupljanja i skladištenja uzoraka, MIQE zahtijeva da to bude jasno napisano u radu, tako da recenzenti mogu provjeriti pouzdanost papira, a također je zgodno za zapanjene mlade da ponove vaš eksperiment.

Iako su biološki eksperimenti teški, oni su vrhunski.Ako niste pažljivi, možete prevrnuti svijet.Na primjer, pretvaranje SARS-a u biohemijsku krizu ili pravljenje hibridnog pirinča da bi se spasilo 1,3 milijarde ljudi.Slika ispod je hemijski eksperiment, trebalo bi da shvatite koliko ste ponosni na svoje istraživanje samo gledajući njegov izgled nalik na kurac.Zaboravi, ne crni ga.

MIQE (3) – ekstrakcija nukleinske kiseline.
Ekstrakcija nukleinske kiseline je veliki događaj, a svi eksperimenti molekularne biologije počinju ekstrakcijom nukleinske kiseline.Prije svega, kopirajmo MIQE-ov sadržaj o ekstrakciji nukleinske kiseline.

Gledajući ovaj obrazac, ne možete ostati na površini.Forma je dogma.Da biste bili vrhunski student, morate se zapitati zašto.Osnovni sadržaj ove tabele je: Progončistoću, integritet, konzistenciju i ekstrakcionu količinu RNK .

Prvi dioproces ili instrument je korak ekstrakcije nukleinske kiseline.Ako za ekstrakciju koristite automatski ekstraktor nukleinske kiseline (napredno, kontaktirajte me za kupovinu), morate navesti naziv modela instrumenta.

Naziv kompleta i

koji komplet je korišten za detalje promjene, koji su specijalni reagensi dodani ili koje su posebne operacije urađene treba jasno objasniti kako bi drugi mogli lako ponoviti vaš eksperiment.

Neki ljudi dodaju neke posebne reagense prilikom vađenja posebnih uzoraka, misleći da je to njihovo tajno oružje i ne govore drugima.Dok to drže u tajnosti, oni također gube priliku da vaš članak zablista.Ne budi pametan, moraš biti pošteniji od seoskog starog Zhanga u naučnim istraživanjima, ako želiš da budeš pametan, članak će te učiniti glupim.

morate zapamtiti broj proizvoda u kompletukada naručite komplet i napišete članak.U principu postoje dva broja na kompletu: Cat—kataloški broj (broj proizvoda, broj artikla), Lot—broj serije proizvoda (koristi se za označavanje iz koje serije dolazi proizvod).

Osim toga, CAS broj se često koristi prilikom naručivanja biohemijskih reagensa, a ja ću ga zajedno popularizirati.CAS broj je broj koji Američko hemijsko društvo daje svakom novom hemijskom leku.Generalno, tri broja su povezana crticom.Rushuijev CAS broj: 7732-18-5.Hemikalije često imaju više alijasa, ali CAS broj je jedinstven.Prilikom naručivanja lijeka prvo možete provjeriti njegov CAS broj.

Bliže kući, zašto moramo jasno opisati ove stvari?U stvari, to je također provjeriti kvalitetu ekstrakcije RNK.Upotreba instrumenata i kompleta će učiniti ekstrakciju RNK konzistentnijom.Skala ekstrakcije običnih laboratorija nije velika i može se nabaviti uz pomoć kompleta.

Detalji tretmana DNase ili RNase
Važno pitanje fluorescentnog kvantitativnog PCR-a je spriječiti kontaminaciju DNK i ne eksperimentirati ako postoji kontaminacija.Stoga je imperativ navesti proces koji ste koristili za obradu DNK, kako biste pokazali da je DNK u eksperimentalnom procesu potpuno i potpuno uklonjena.predstavljeno šematskim dijagramom.

Šematski dijagram RNK i DNK
Općenito, metoda za uklanjanje DNK je tretiranje RNK sa DNazom nakon ekstrakcije.Međutim, ovo su relativno stare metode.Komercijalni kompleti za ekstrakciju RNK su bili u stanju da uklone DNK tokom procesa ekstrakcije bez dodavanja DNaze.Na primjer, serija kompleta iz Foregene.

Bilješka: Uklanjanje DNK tokom ekstrakcije RNK je veoma opasan mač sa dve oštrice, koji će produžiti vreme operacije ekstrakcije RNK i povećati rizik od degradacije RNK.U osnovi, to je kompromis između prinosa RNK i čistoće.

Osim toga, količina DNaze koja se dodaje u adsorpcionu kolonu na bazi silicijum-dioksida je vrlo mala, a za postizanje efekta mora se koristiti visokokvalitetna DNaza.Neoptimizirana Dnaza se ne može brzo i potpuno probaviti.Ovo je test tehničkog nivoa trgovca.Naravno, ima još čudnijih trgovaca koji se hvale da se DNK može ukloniti bez Dnaze.Može se reći da je huligan svako ko se hvali da se DNK može potpuno ukloniti bez DNaze.DNK je relativno stabilna dvolančana struktura i ne može se izbrisati samo razgovorom i smehom.

Procjena kontaminacije
metoda procjene: detekcija elektroforezom, 1% agaroza, 6V/cm, 15min, punjenje 1-3 ul

Kvantitativna analiza nukleinske kiseline
se obično mjeri pomoću UV spektrofotometra.Dozvolite mi da prvo populariziram značenje tri vrijednosti OD260, OD280 i OD230.
·OD260nm: To je apsorpciona talasna dužina najvišeg apsorpcionog vrha nukleinske kiseline, a najbolje izmerena vrednost se kreće od 0,1 do 1,0.Ako nije, razrijedite ili koncentrirajte uzorak kako biste ga doveli u domet.
·OD280nm: To je talasna dužina apsorpcije najvećeg apsorpcionog vrha proteina i fenolnih supstanci.
·OD230nm: To je talasna dužina apsorpcije najvećeg apsorpcionog vrha ugljenih hidrata.

Zatim, hajde da razgovaramo o ulozi svakog indikatora.Za A260, može se koristiti za mjerenje prinosa nukleinske kiseline.Kada je OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Za čistoću, moramo pogledati omjere koje obično vidimo: OD260/280 i OD260/230.
·Čista DNK: OD260/280 je približno jednak 1,8.Kada je veći od 1,9, to znači da postoji zagađenje RNK, a kada je manji od 1,6, to znači da postoji zagađenje proteinima i fenolom.
·Čista RNK: 1.7
·OD260/230: Bilo da se radi o DNK ili RNK, referentna vrijednost je 2,5.Kada je manji od 2,0 znači da postoji zagađenje šećerom, solju i organskim materijama.

integritet RNK

Veoma je važno izmjeriti integritet RNK.Općenito, potrebno je napraviti eksperiment denaturacije RNK u gelu kako bi se provjerilo da li je sjaj između 28S i 18S RNK dvostruki odnos.Kada se pojavi treća traka 5S, to znači da je RNK počela da se razgrađuje, osim za beskičmenjake.

Podaci za procjenu kvaliteta RNK: Pored gore navedenih testova, postoje i neki napredniji instrumentalni testovi u pogledu integriteta RNK, kao što je RQI test integriteta Experion sistema za automatsku elektroforezu, koji može otkriti da li je RNK nevidljivo degradirana.

U naučnim istraživanjima, fluorescentni kvantitativni PCR je poređenje između ciljnog gena i internog referentnog gena.Stoga, u procesu očuvanja uzorka RNK, ekstrakcije RNK itd., primarni cilj je osigurati integritet RNK.

Kako integritet RNK utječe na ravnotežu između ciljnog gena i internog referentnog gena može se lako razumjeti iz donje slike.Degradacija će dovesti do nekompletnosti gena, bilo da je u pitanju nekompletnost internog referentnog gena ili nekompletnost ciljnog gena, to će imati veliki uticaj na podatke.

Šematski dijagram ciljnog gena i referentnog gena, ne smije biti istinit

Test inhibicije (da li je CT vrijednost potisnuta pod visokom ili niskom koncentracijom ili drugim uvjetima)

Uzimajući ovu sliku kao primjer, vrijednosti Ct za pet krivulja su sljedeće.Raspodjela CT vrijednosti između krivulja je neujednačena, a vrijednosti Ct kasne pod visokim i niskim koncentracijama, što je slučaj PCR inhibicije.

Ključna stvar: U procesu ekstrakcije RNK moramo napustiti zablude i uspostaviti ispravne.

Pogrešna ideja je: ekstrakcija RNK samo teži prinosu, misleći da što je veća količina RNK dobijena, to bolje.U stvari, kada radimo kvantifikaciju, ako broj gena nije veliki, ne treba nam mnogo RNK.Količina RNK koju ekstrahujete je više nego dovoljna.

Ispravan koncept je:Ekstrakcija RNK treba težiti čistoći, integritetu i konzistentnosti.Čistoća može osigurati da naknadna reverzna transkripcija nije inhibirana i da DNK neće utjecati na podatke.Integritet osigurava ravnotežu ciljnih sekvenci i internih referenci.Konzistentnost osigurava stabilno punjenje uzorka.

MIQE (4) – reverzna transkripcija
Misconception: težnja za većom zapreminom uzorka.
Ispravan koncept: Težite konzistentnosti (stabilnosti), bez obzira na količinu napunjene RNK, efikasnost reverzne transkripcije ostaje dosljedna, osiguravajući da razlike u cDNK zaista mogu odražavati razlike u mRNA.
Ovaj proces objašnjavamo šematskim dijagramom:

Šematski dijagram efikasnosti reverzne transkripcije, nije tačan
Prije svega, moramo razumjeti razliku između procesa reverzne transkripcije i PCR procesa.PCR prolazi kroz višestruke procese zagrijavanja i žarenja, a ciljni fragment raste eksponencijalno;dok reverzna transkripcija nema ovaj proces, možemo zamisliti da je reverzna transkripcija zapravo jedan na jedan. Tokom procesa replikacije, onoliko komada RNK

pošto postoji može se dobiti što više komada cDNK Informacije, to bi do sada trebalo shvatiti, jer su veliki i mali fragmenti reverzno transkribovani i nemoguće je fokusirati se na jedan fragment.A budući da je količina RNK relativno mala, količina dobijene cDNK je također relativno mala, za razliku od PCR-a, koji ima učinak amplifikacije, pa ga je u osnovi nemoguće otkriti.

Rezultati cDNA elektroforeze
Drugo, u idealnom slučaju, reverzna transkripcija se izvodi jedan na jedan, ali nijedna reverzna transkriptaza bilo koje kompanije ne može postići ovaj efekat.U osnovi, efikasnost većine reverznih transkriptaza se kreće između 30-50%.Ako je to slučaj, radije bismo imali relativno stabilnu efikasnost reverzne transkripcije, što želimo da vidimo na slici: 3 RNK dobijaju 2 cDNK, 6 RNK dobijaju 4 cDNK, tako da bez obzira koliko je uzorak učitan, efikasnost reverzne transkripcije je relativno stabilna.Ne želimo da vidimo situaciju u kojoj je efikasnost reverzne transkripcije nestabilna i visoka koncentracija inhibirana.

Dakle, kako provjeriti da li je efikasnost reverzne transkripcije stabilna?Metoda je vrlo jednostavna, potrebno je samo napraviti uporedni test: jedan je reverzna transkripcija u cDNK nakon udvostručenog razrjeđivanja RNK, a druga je dvostruko razrjeđenje nakon reverzne transkripcije u cDNK, a zatim uraditi qPCR da vidite dobijeni nagib Da li je konzistentan.Kao vrhunski student, trebali biste to razumjeti za nekoliko sekundi.Kao što je prikazano u nastavku:

Razblaživanje RNK i cDNK da bi se testiralo da li je efikasnost reverzne transkripcije stabilna
Reverzna transkriptaza i komplet
Kako savršeni fluorescentni kvantitativni PCR može imati odličnu reverznu transkriptazu i komplet.Reverzna transkriptaza se grubo dijeli na dvije vrste prema izvoru, AMV iliM-MLV, a njihova izvedba je ista kao ona prikazana u tabeli.

Aktivnost RNaze H
RNaza H je ribonukleaza H, kineski naziv je ribonukleaza H, što je endoribonukleaza koja može specifično hidrolizirati RNK u DNK-RNA hibridnom lancu.RNaza H ne može hidrolizirati fosfodiestarske veze u jednolančanoj ili dvolančanoj DNK ili RNK, odnosno ne može probaviti jednolančanu ili dvolančanu DNK ili RNK.Obično se koristi u sintezi drugog lanca cDNK.

To je čudna stvar.Kažemo da reverzna transkriptaza ima aktivnost RNaze H, a ne da reverzna transkriptaza sadrži RNazu H, i možda neće biti moguće odvojiti RNazu H od reverzne transkriptaze, možda zbog konformacije određenih grupa u reverznoj transkriptazi. Ova aktivnost je uzrokovana reverznom transkriptazom.

Stoga, bez obzira na veću efikasnost reverzne transkripcije AMV-a, njegova aktivnost RNaze H smanjuje prinos cDNK.Naravno, proizvođači reagensa stalno optimizuju svoje proizvode kako bi eliminisali aktivnost RNaze H u reverznoj transkriptazi što je više moguće kako bi povećali prinos cDNK.
Temperatura žarenja

Sekundarna struktura RNK na različitim temperaturama
Pogledajte gornju sliku za sekundarnu strukturu RNK na različitim temperaturama i koristite online alat mFold da odredite sekundarnu strukturu ciljnog fragmenta pod određenim temperaturnim uvjetima i uvjetima koncentracije soli.Na 55°C, sekundarna struktura RNK je još uvijek vrlo složena, reverzna transkriptaza ne može funkcionirati, a sekundarna struktura se ne može potpuno razriješiti do 65°C, dok je optimalna temperatura AMV i M-MLV daleko niža od ove temperature.
šta da radim?Sekundarna struktura je komplementarno uparivanje samog predloška, ​​što dovodi do jake konkurencije između prajmera i reverzne transkriptaze i šablona, ​​što rezultira nizom problema kao što su nizak E i loša ponovljivost.

šta da radim?Samo povećajte temperaturu žarenja što je više moguće.

Mnogi proizvođači reagensa poboljšavaju svoju reverznu transkriptazu putem genetskog inženjeringa.Neki povećavaju temperaturu reakcije, kao što su Jifan i Aidelai, a neki uklanjaju aktivnu grupu enzima RNase H kako bi poboljšali afinitet između enzima i RNA šablona.Visok afinitet može konkurentno istisnuti sekundarnu strukturu i nesmetano čitati, a također uvelike poboljšati efikasnost reverzne transkripcije.
Ključna stvar: Reverzna transkripcija je važnija za postizanje konzistentnosti efikasnosti reverzne transkripcije (enzimi moraju biti ne samo efikasni, već i stabilni), nego za količinu učitanog uzorka, ako to nije fluorescentni kvantitativni PCR posebno velikih razmjera, to uopće neće biti moguće.Više cDNK.
Razni proizvođači su također uložili određene napore u potrazi za dosljednošću.Na primjer, većina kompanija sada ima obrnutu transkripciju kao standardni komplet za prodaju, što je dobar izbor.
Na primjer, Foregene RT Easy Series kompleti:

RT Easy I (Master premiks za komplet za sintezu cDNK prvog lanca)

MIQE (5) – informacije o ciljnom genu

Gornja slika objašnjava
1. Da li je ovaj gen efikasan za ponovljene eksperimente generalno se može potvrditi ponovljenim eksperimentima.
2. Gen ID, znate.
3. Dužina gena, ukupna dužina ciljnog gena definitivno nije problem.Prilikom dizajniranja prajmera, pobrinite se da dužina amplikona bude između 80-200bp kako biste osigurali bolju efikasnost amplifikacije.
4. Informacije o poređivanju sekvenci, ciljni gen treba uporediti u banci gena kako bi se spriječilo nespecifično pojačanje.
5. Prisustvo pseudogena.Pseudogen je DNK sekvenca slična normalnom genu, ali gubi svoju normalnu funkciju.Često postoji u višegenskoj porodici eukariota.Obično se predstavlja sa ψ.To je nefunkcionalna genomska DNK kopija u genomu koja je vrlo slična kodirajućoj sekvenci gena., uglavnom se ne transkribiraju i nemaju jasno fiziološko značenje.
6. Položaj prajmera u odnosu na egzone i introne.U ranim godinama, kada smo rješavali problem kontaminacije DNK, često smo obraćali pažnju na položaje prajmera, egzona i introna i općenito razmatrali dizajniranje prajmera preko introna kako bismo izbjegli amplifikaciju DNK.Molimo pogledajte sliku ispod: crna predstavlja introne, razne plave predstavljaju egzone, ružičasta predstavlja uobičajene prajmere, a svijetlo crvena predstavlja prajmere koji se protežu kroz introne.

Šematski, nikad istinito
Kako se ovo čini savršenim planom, ali u stvari, u većini slučajeva, trans-intronski prajmeri nisu tako magični kao što se zamišlja, a također će uzrokovati nespecifično pojačanje.Dakle, najbolji način da se spriječi kontaminacija DNK je potpuno uklanjanje DNK.
7. Predviđanje konformacije.Ponovo koristeći ovaj primjer, koristite online alat mFold da odredite sekundarnu strukturu ciljanog fragmenta na određenoj temperaturi i koncentraciji soli.

Sekundarna struktura RNK na različitim temperaturama
Sekundarna struktura je komplementarno uparivanje samog šablona, ​​što će dovesti do jake konkurencije između prajmera i uparivanja šablona, ​​a šanse za vezivanje prajmera su manje, što rezultira nizom problema kao što je nizak E i loša ponovljivost.Kroz softversko predviđanje, ako nema problema sa sekundarnom strukturom, to bi bilo sjajno.Ako postoji, naš sljedeći članak će posebno govoriti o tome kako riješiti ovaj problem.

MIQE (6)—qPCR oligonukleotidi

Za fluorescentni kvantitativni PCR, prva stvar s kojom se svakodnevno borite je ekstrakcija RNK, a druga stvar može biti dizajn prajmera.
Prije svega, još uvijek provjeravamo pravila o dizajnu prajmera prema MIQE kontrolnoj listi.Toliko je jednostavno da se ološi mogu nasmijati, a možemo to završiti u jednoj rečenici: saznajte redoslijed i položaj sonde prajmera i način modifikacije.Za metodu prečišćavanja prajmera, sinteza prajmera je trenutno toliko jeftina, qPCR je dostojan PAGE i iznad metoda prečišćavanja, a informacije o instrumentu za sintezu nisu važne.Mnogi ljudi rade prajmere decenijama i ne znaju da je sintisajzer ABI3900.
Što se tiče principa dizajna bukvara, ne morate ih pamtiti napamet, jer većina softvera za dizajn bukvara ili online alata može riješiti ove probleme (preporučeni online alat primer3.ut.ee/), a 99,999% dizajna početnica se ne radi ručno Vidite, autor ponekad dizajnira stotine bukvara dnevno, ako čitate jedan po jedan, to će postati križno.
Samo provjerite sljedeće točke nakon što su prajmeri dizajnirani:
1. Dizajnirajte prajmere blizu 3′ kraja: U slučaju upotrebe oligo dT prajmera za sintezu prvog lanca cDNK, s obzirom na efikasnost reverzne transkripcije i integritet RNK, dizajnirani prajmeri moraju biti dizajnirani blizu 3′ kraja kako bi se poboljšala efikasnost amplifikacije.Koristite sliku da objasnite sljedeće (ne postoji način da se ovo razumije):

Zašto bi prajmeri trebali biti dizajnirani blizu 3′ kraja, to ne smije biti istina
2. TM vrijednost: Tm vrijednost je na 55-65°C (jer je aktivnost egzonukleaze najveća na 60°C), a sadržaj GC je na 40%-60%.
3. BLAST: Da bi se izbjegla nespecifična amplifikacija genoma, Blast se mora koristiti za dodatnu verifikaciju.

MIQE(7)—qPCR proces

1. qPCR komplet
Prema zahtjevima MIQE-a, u članku moramo jasno opisati kompletne uslove reakcije, uključujući konfiguraciju PCR reakcijskog sistema, koji se komplet koristi, ko je proizvođač, koliki je reakcioni sistem, da li se koristi metoda bojenja ili metoda sonde, postavke PCR programa.Vozači veterani će definitivno otkriti da sve dok je komplet odabran, gornje informacije su u osnovi određene.
Trenutno je proizvodnja i proizvodnja fluorescentnih kvantitativnih PCR kompleta veoma zrela tehnologija.Sve dok ne birate izuzetno loše proizvođače, vjerovatnoća problema nije velika, ali ipak želimo podijeliti s vama nekoliko stvari:
Hot-start Taq enzim:Najvažniji dio PCR-a je hot-start Taq enzim.Hot-start enzimi na tržištu općenito se dijele na dvije vrste, jedan je kemijski modificirani hot-start enzim (možete ga zamisliti kao ugrađivanje parafina), a drugi je enzim vrućeg starta za modifikaciju antitijela (vezivanje antigen-antitijela).Hemijska modifikacija je rani način pokretanja enzima u vrućem stanju.Kada se postigne određena temperatura, enzim će osloboditi svoju aktivnost.Hot-start enzim modificiran antitijelima koristi biološke metode za blokiranje aktivnosti enzima.Kada se dostigne određena temperatura, antitijelo će biti denaturirano i inaktivirano kao protein, a aktivnost enzima će se aktivirati.

Međutim, koja je korist od ovoga?To je slučaj, aktivnost oslobađanja enzima modificiranih antitijelima je brža nego kod kemijski modificiranih enzima, tako da u pogledu osjetljivosti enzimi modificirani antitijelima imaju malu prednost, tako da u principu nema kemijski modificiranih enzima u kompletima na tržištu.Ako postoji, onda je tehnologija ovog proizvođača još uvijek zaglavljena u eri milenijuma.
Koncentracija jona magnezijuma:Koncentracija jona magnezijuma je veoma važna u PCR reakciji.Odgovarajuća koncentracija magnezijevih jona može potaknuti oslobađanje aktivnosti Taq enzima.Ako je koncentracija preniska, aktivnost enzima će biti značajno smanjena;ako je koncentracija previsoka, enzimski katalizirana nespecifična amplifikacija će biti pojačana.Koncentracija jona magnezijuma će takođe uticati na žarenje prajmera, temperaturu topljenja šablona i PCR proizvoda, čime će uticati na prinos amplificiranih fragmenata.Koncentracija jona magnezija se općenito kontrolira na 25 mM.Naravno, za dobar komplet, koncentracija magnezijevih jona mora biti dobro kontrolirana.Neki trgovci reagensu dodaju agens za heliranje magnezijevih jona, čime se postiže efekat automatskog podešavanja koncentracije magnezijevih jona.
Koncentracija fluorescentne boje:Fluorescentna boja, koja je SYBR Green koju obično koristimo, uglavnom generiše fluorescenciju vezivanjem za manji žleb dvolančane DNK, jer je vezivanje boje za dvolančanu DNK nespecifično, to jest sve dok se dvolančana DNK može kombinovati s njom, tako će se fluorescentni sistem kombinovati sa njom i formiraće se prajmer u sistemu DNK. pozadinski signal.
PS: Zbog svojih svojstava osjetljivosti na svjetlost, proizvodi na tržištu se uglavnom pakuju u smeđe neprozirne epruvete za centrifugiranje (kao što je prikazano na slici ispod).Međutim, to će naići na problem.Teško je uočiti da li je tečnost usisana prilikom uzorkovanja.U tom pogledu, Qingke je zaista najprikladniji za upotrebu (kao što je prikazano na slici ispod), a prozirna cijev je upakovana u neprozirnu limenu vrećicu.Zatim ga stavite u limenu vrećicu, vodeći računa o praktičnosti izbjegavanja svjetlosti i uzorkovanja.Morate odabrati pravi broj proizvoda.TSE204 je super isplativa egzistencija, zbog čega želim da sadim travu.

Koncentracija fluorescentne boje je također vrlo važna.Ako je koncentracija preniska, krivulja pojačanja neće rasti u kasnijoj fazi i nije savršena;ako je koncentracija previsoka, to će uzrokovati smetnje buke.Pošto fluorescentni kvantitativni PCR uglavnom zavisi od CT vrednosti, ako koncentracija fluorescentne boje nije pravilno podešena, niska tačka je bolja od visoke tačke.Naravno, odgovarajuća koncentracija boje je najbolja.

ROX: ROX boje se koriste za ispravljanje grešaka signala fluorescencije od bunara do bunara.Neki proizvođači instrumenata zahtijevaju kalibraciju, dok drugi ne.Na primjer, korištenje Thermo Fisher Scientific PCR instrumenta za pojačavanje u realnom vremenu obično zahtijeva kalibraciju, uključujući 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, itd. Opšte upute za komplet će to opisati.
Foregene-ov qPCR Mix također sadrži ROX boju, koja je zgodna za korištenje u različitim modelima.

Real Time PCR Kit-Taqman

Tretman slabom vodoničnom vezom: Tretman slabih vodoničnih veza je relativno tehnička stvar.Ništa nije pročitalo priručnike mnogih kompleta, ali nijedan od njih nije pomenuo ovu temu.U stvari, to je tako važno.Kombinacija baza uglavnom zavisi od jačine vodikovih veza.Jake vodonične veze su normalno pojačanje, a slabe vodikove veze dovode do nespecifičnog pojačanja.Ako se slabe vodikove veze ne mogu dobro eliminisati, nespecifično pojačanje se ne može izbjeći.U okviru autora, samo nekoliko kompanija je uočilo ovaj problem.Kada kupujete komplet, možete se osvrnuti na to da li ste razmatrali rješenje u tom pogledu za komplet koji želite da odaberete.

Volumen reakcije: Sistem od 20-50ul se češće koristi, a manje količine će vjerovatno uzrokovati greške.Uopšteno govoreći, uputstva za komplet će preporučiti upotrebu zapremina PCR reakcije.Nemojte biti pametni i koristite manje količine da uštedite troškove.cilj.Volumen koji su trgovci preporučili je zapravo testiran i može se dogoditi da ne mogu riješiti problem grešaka uzrokovanih malim količinama.
2. Proizvođač i broj artikla cijevne ploče
Svima je poznat princip fluorescentnog kvantitativnog PCR-a.Sakupljanje fluorescencije se uglavnom provodi preko PCR kapica za epruvete.Prilikom odabira potrošnog materijala za PCR obratite pažnju na dvije točke: dobar prijenos svjetlosti i prikladan za instrument.Uopšteno govoreći, ploče i cijevi mainstream brendova su u redu, ali morate pažljivo birati u smislu prilagođavanja, inače nećete moći koristiti instrument.

4. Vrhunski nivo znanja

MIQE (8)—qPCR validacija
Ovo je glavni prioritet qPCR-a!Toliko heroja je ovdje palo u pijesak.Naravno, moguće je i da imate sreće i da su geni koje ste proučavali jednostavni, pa ste plutali kroz ledenu pećinu uz vjetar.Informacije o verifikaciji qPCR-a imaju za cilj da testiraju pouzdanost podataka.Navodimo potrebne informacije za verifikaciju na sljedeći način:

1.Test specifičnosti
Specifičnost amplifikacije ciljnog gena se testira provjeravanjem da li je slika elektroforeze jednostruka;verifikacija sekvenciranja;krivulja topljenja da se vidi da li je mapa vrhova jednostruka;provjera enzimske probave i druge metode.
Ovdje se fokusiramo na tanaliza nespecifične amplifikacije metodom krivulja topljenja.Uopšteno govoreći, kada dizajniramo prajmere, potrebno je da veličina fragmenta proizvoda bude u rasponu od 80-200bp, što čini temperaturu topljenja PCR proizvoda u rasponu od 80-85 °C.Stoga, ako postoje različiti pikovi, moraju postojati i drugi nespecifični proizvodi amplifikacije;ako se vrh pojavi ispod 80°C, generalno se smatra da je prajmer dimer;ako se vrh pojavi iznad 85°C, općenito se smatra da je to kontaminacija DNK ili više nespecifične amplifikacije velikih fragmenata.
Napomena: Ponekad postoji samo jedan vrh na 80°C.U ovom trenutku, ovaj koncept se mora pridržavati.Vjerovatno je da su rezultati amplifikacije svi dimeri prajmera.

Normalna kriva topljenja (jedan vrh bez nespecifičnog pojačanja)

Problematična kriva topljenja (nespecifično pojačanje lažnih pikova)
【Analiza slučaja】

Postoji glavni vrh, ali dimer prajmera je ozbiljan
Krivulja topljenja sa jednim vrhom na slici ispod može lako zavarati vaše oči, misleći da je to savršen eksperiment, ali rezultat je potpuno pogrešan.U ovom trenutku moramo pogledati temperaturu topljenja.Maksimalna temperatura je ispod 80°C, što je potpuno prajmer-dimer.

Nema ciljanog fragmenta, svi dimeri prajmera
Evo, moj brat ne može stati.Slika ispod je fotografija snimljena mobilnim telefonom koji mi je poslao jedan ološ.Reagensi koje je koristio su svi uobičajeni brendovi u industriji.Prešao je s jedne marke T-prefiksa na drugu marku T-prefiksa.Mislim da ste već pogodili.Ološ mi je zavapio: „Reagens koji se koristi na prvoj slici je predobar, a vrh je jedan.Kasnije, nakon upotrebe reagensa koji ste preporučili, postaje kao na drugoj slici, sa pomiješanim pikovima.Učinio si me nesretnim.“
Odvojite dva grafikona.Na prvi pogled, jedan ima jedan vrh, a drugi dvostruki vrh.Gluposti, jedan vrh je naravno u redu.Je li to istina?
Gore od Dou E, ako stavim dvije slike na sliku ispod, odmah ćete razumjeti.U stvari, ovakva slika nas lako paralizira.Nakon pažljive analize, otkrili smo da je: vrh prve brojke na 75°C, što je u potpunosti prajmer dimer;vrh druge brojke se pojavljuje na 75°C i 82°C, barem postoje. Proizvod se pojavljuje.

Slike povratnih informacija učenika
Dakle, osnovni problem nije problem reagensa, već problem dizajna prajmera.Istovremeno, to takođe dokazuje da neki veliki brendovi nisu kvalitetnog gvožđa, a takođe dokazuje i ono što je moj brat ranije rekao: Nije marka reagensa ta koja podržava vaš članak.Vaš članak je podržao brend reagensa.Zamislite samo, da ološ nije promijenio reagense, pogrešni podaci bi bili poslani u dnevnik, a ono što bi se dogodilo bila bi tragedija.
2. Ct vrijednost prazne kontrole
Ne objašnjavajte, ako prazna kontrola ima Ct vrijednost, nije li zagađenje?Međutim, još uvijek morate razumjeti koja prazna kontrola ima Ct vrijednost.Ako je NTC, to znači da postoji strana DNK kao što je kontaminacija reagensom.Ako je NRT, to znači da ekstrahirana RNK ima kontaminaciju DNK.
3. Standardna kriva
Uključujući nagib i formulu izračuna, efikasnost PCR-a može se izračunati preko formule.Savršen eksperiment zahtijeva da se nagib standardne krive približi 3,32, a R² da se približi 0,9999.
4. Linearni dinamički raspon
Dinamički raspon reakcije je linearan.Prema šablonu koji se koristi za generiranje standardne krive, dinamički raspon treba uključivati ​​najmanje 5 gradijenta koncentracije i obratiti pažnju na promjenu vrijednosti Ct pri visokim gradijentima koncentracije i niskim gradijentima koncentracije.
5. Preciznost detekcije
Promjene u rezultatima qPCR-a, odnosno loša ponovljivost, odnosno slaba preciznost, uzrokovane su mnogim faktorima, uključujući temperaturu, koncentraciju i rad.Preciznost qPCR-a općenito postaje manje podložna kontroli kako se broj kopija smanjuje.U idealnom slučaju unutar eksperimentalne varijacije, ova tehnička varijacija bi se trebala razlikovati od biološke varijacije, a biološke replikacije mogu direktno riješiti statističke razlike u qPCR rezultatima između grupa ili tretmana.Posebno za dijagnostičke testove, mora se prijaviti najbolja preciznost među testovima (ponovljivost) na svim lokacijama i operaterima.
6. Efikasnost detekcije i LOD (u multipleksu qPCR)
LOD je najniža koncentracija od 95% otkrivenih pozitivnih uzoraka.Drugim riječima, koncentracija LOD-a sadržana u setu replika ciljnog gena ne bi trebala prelaziti 5% neuspjelih reakcija.Kada se radi multipleks qPCR analiza, posebno za istovremeno otkrivanje tačkastih mutacija ili polimorfizama, multipleksni qPCR treba da pruži dokaz da tačnost višestrukih ciljnih fragmenata nije ugrožena u istoj epruveti, višestruka detekcija i detekcija u jednoj epruveti Efikasnost i LOD treba da budu isti.Naročito kada se istovremeno pojačavaju ciljni geni visoke koncentracije i ciljni geni niske koncentracije, ovom problemu se mora obratiti pažnja.
Problemi i rješenjaUopšteno govoreći, problemi koji se često susreću u qPCR otklanjanju grešaka fokusiraju se na sljedeće aspekte:
·nespecifična amplifikacija
·Težak izbor koncentracije prajmera i problem sa prajmer-dimerima
· Temperatura žarenja je netačna
· Sekundarna struktura utiče na efikasnost pojačanja
nespecifično pojačanje
nespecifično pojačanje, općenito se smatra da dizajn prajmera nije prikladan, ali ako ne žurite s promjenom prajmera, prvo možete isprobati sljedeće metode (princip je također u prilogu):
·Povećajte temperaturu žarenja – pokušajte da slabe vodonične veze ne mogu da se održe;
·Skratiti vrijeme žarenja i istezanja – smanjiti mogućnost slabih vodoničnih veza;
·Smanjiti koncentraciju prajmera – smanjiti mogućnost vezivanja suvišnih prajmera i neciljanih regiona;
Niska efikasnost pojačanja
Situacija suprotna od nespecifičnog pojačanja – niska efikasnost pojačanja, a mjere za rješavanje niske efikasnosti pojačanja su upravo suprotne:
·Produžite vrijeme žarenja i istezanja;
· Pređite na PCR u tri koraka i smanjite temperaturu žarenja;
·Povećati koncentraciju prajmera;
Ps: Mnogi diplomirani studenti rođeni 90-ih ne žele proučavati kako da otklone eksperimente, i nadaju se da komplet može u potpunosti riješiti problem (ako želite otići u kompaniju reagensa da se bavi istraživanjem i razvojem nakon diplomiranja), u stvari, proizvođači reagensa također misle na ovaj način, nadam se da je budala Može se koristiti kada ga dobijete, tako da su utrošeni veliki napori proizvođača reagensa na rješavanje problema nespecifičnih reagensa. slabi faktori apsorpcije H-veze.Da bi lako riješili problem, budale još uvijek moraju pročitati uvod kompanije reagensa da vide postoji li faktor koji apsorbira slabe vodikove veze.
Težak izbor koncentracije prajmera i problem sa prajmer-dimerima
Metoda 1: Uopšteno govoreći, uputstva u kompletu za qPCR sadrže preporučene sisteme i preporučene koncentracije prajmera.
Metoda 2: Otklanjanje grešaka postavljanjem gradijenta koncentracije prajmera.Slika ispod je ukradena iz kompanije radi ilustracije.Slika ispod prikazuje kvantitativne rezultate fluorescencije napravljene sa tri gradijenta koncentracije prajmera (100nM, 250nM, 500nM) i četiri gradijenta koncentracije šablona (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Vrijednost Ct eksperimentalnih rezultata je prikazana na sljedeći način:

Odabir koncentracije prajmera Spojite svaku koncentraciju prajmera u liniju na sljedeći način:

Izbor koncentracije prajmera je očigledan, linearni odnos koncentracije prajmera od 100nM i 250nM je bolji, a linearni odnos koncentracije prajmera od 500nM je relativno loš.Kod 100nM i 250nM, vrijednost Ct od 250nM je relativno mala, tako da je optimalna koncentracija prajmera 250nM.Generalno, jaki dimeri prajmera mogu se videti na krivulji topljenja.Šta ako dizajnirani prajmeri ne mogu izbjeći prajmer-dimere?
Metoda 3: Smanjite količinu prajmera i povećajte temperaturu žarenja (nema potrebe objašnjavati).
Empirijska vrijednost temperature žarenja je 60°C.Ako niste sigurni, kako odabrati prikladniju temperaturu žarenja?Odgovor je isti kao i izbor koncentracije prajmera –gradijent test.Slikajte od kompanije Bio-rad kako biste ilustrirali problem.Za amplifikaciju određenog ciljnog fragmenta, postavite osam temperaturnih gradijenata, svaki sa tri ponavljanja, a dobijena krivulja amplifikacije je sljedeća:

izbor temperature žarenja:
·70°C, 69°C—U osnovi, prajmeri se ne mogu kombinovati, tako da nema amplifikacije.
·67,3°C – Postoji mala količina pojačanja na početku, a vrijednost Ct je relativno velika.
·64,5°C——Ct vrijednost se smanjuje.
·Na 60,7°C, 58,0°C, 56,2°C i 55,0°C, vrijednosti Ct su u osnovi imale tendenciju da budu stabilne, ali su konačne vrijednosti fluorescencije bile različite.
Kako odabrati?Princip: Prvi princip je veća Ct vrijednost.Za istu vrijednost Ct odaberite višu temperaturu žarenja kako biste izbjegli dimerizaciju i nespecifično pojačanje.Iako postoji veća vrijednost fluorescencije na 55°C, u njoj mogu biti dimeri ili nespecifična amplifikacija.
Ali ako ste pametni kao vi, sigurno ćete pomisliti: Logično gledano, ako je PCR reakcija vrlo specifična, sve dok koncentracija prajmera prelazi minimalni zahtjev, visoke i niske točke ne bi trebale imati efekta, baš kao fluorescentne boje i dNTP.Zaista, sve dok je temperatura žarenja pravilno optimizirana, efekat koncentracije prajmera na vrijednost Ct će prirodno biti minimiziran.

Temperatura žarenja je pravilno optimizirana, a učinak koncentracije prajmera na CT će biti minimiziran
Sekundarna struktura utiče na efikasnost amplifikacije
Uzmimo sliku sa Bio-rada da ilustriramo problem.Takođe dizajnira temperaturni gradijent za amplifikaciju gena sa sekundarnom strukturom.

Pojavljuje se sekundarna struktura
Može se vidjeti da kako se temperaturni gradijent smanjuje, proizvodi počinju da se pojavljuju i vrijednost Ct se kreće naprijed, dostižući minimalnu vrijednost na 60,7°C, a zatim kako se gradijent temperature smanjuje, vrijednost Ct postaje veća.Suprotno tome, kako temperatura raste, otvara se sekundarna struktura i povećava se efikasnost pojačanja.Nakon postizanja određene temperature, povećanje temperature ne može poboljšati efikasnost pojačanja.Zato što se prajmeri u ovom trenutku ne mogu stabilno kombinovati.stoga,potražite temperaturu s najnižom Ct vrijednošću, što je najbolja temperatura za pojačavanje šablona sekundarne strukture!Naravno, pametne budale moraju znati da ako nije potrebno, najbolje je promijeniti prajmere i izbjeći područje sekundarne strukture.
5. Nivo aplikacije
MIQE—Analiza podataka

Analizu podataka uglavnom daje fluorescentni kvantitativni PCR instrument.U prethodnom članku je urađeno dosta analize podataka, kao što je blanko kontrola, što je objašnjeno u dizajnu eksperimenta.Interni referentni geni, brojevi ponavljanja, itd. su razjašnjeni., ovdje uglavnom objašnjavamo primjenu qPCR-a.
qPCR se široko koristi, a eksperimentalna verifikacija i dijagnoza nukleinske kiseline su najčešće korišteni scenariji.
apsolutna kvantifikacija
Log (početna koncentracija) ima linearnu vezu sa brojem ciklusa.Standardna kriva se može nacrtati iz standarda sa poznatim početnim brojem kopije, odnosno može se dobiti linearni odnos reakcije pojačanja.Prema Ct vrijednosti uzorka može se izračunati koncentracija u uzorku.Količina šablona za uključivanje.

Metoda apsolutnog kvantitativnog izračunavanja
Apsolutna kvantifikacija mora biti zasnovana na standardnoj krivulji.Za izradu standardne krive potreban je standard.Obično je standard plazmid dobijen kloniranjem ciljnog gena.Zašto je to plazmid?Zato što je kružna plazmidna DNK najstabilnija.Standardni proizvod razblažite u 5 do 6 gradijenta prema omjeru udvostručavanja (10-struko razrjeđivanje), i obratite pažnju na ujednačenost prilikom razrjeđivanja.Neka vrijednost Ct padne između 15-30.

Standardna priprema
U isto vrijeme, uzorak koji se testira treba također biti razrijeđen u skladu s tim (zapamti faktor razrjeđenja), a vrijednost Ct također treba pasti između 15-30.Standardni proizvod + uzorak za testiranje stavljaju se na mašinu zajedno.Nakon rada, napravljena je standardna kriva sa standardnom supstancom, a uzorci koji su se testirali dovedeni su u standardnu ​​krivu radi izračunavanja koncentracije.
Kvantifikacija HBV virusa hepatitisa B je tipična apsolutna kvantifikacija, koja može izračunati broj kopija virusa u 1 ml krvi.
Proračun broja kopija
Koncentracija uzorka za testiranje (ng/ul) = OD260 × 50 ug/ml × faktor razrjeđenja
Molekulska težina uzorka = broj baza × 324
Broj kopija uzorka koji se testira (kopije/ul) = koncentracija uzorka koji se ispituje / molekulska težina uzorka × 6 × 1014

Metoda obračuna broja kopije

Gore navedeni način obračuna za određivanje količine.Ovo je matematički problem koji se može riješiti nakon završetka srednje škole, a matematičke probleme uglavnom rješavaju kompjuteri.Ako ne razumete, možete doći da komunicirate.
relativna kvantifikacija
Relativna kvantifikacija se uglavnom koristi u naučnim istraživanjima.Koliko virusa ima u 1 ml krvi, a to je DNK virus, to je relativno deterministički događaj: količina krvi se može odrediti, a DNK virus je relativno stabilan.Međutim, teško nam je uporediti broj transkripcijskih kopija određenog gena u listu, jer je teško odrediti veličinu, težinu i nježnost lista, teško je odrediti količinu ekstrahirane RNK, a teško je odrediti i efikasnost reverzne transkripcije, odnosno bilo koji korak može dovesti do toga da eksperimentalni podaci imaju greške i ne mogu se koristiti.
Stoga, relativna kvantifikacija mora uvesti element:interni referentni gen.
Drugim riječima, relativna kvantifikacija je zapravo poređenje između ciljnog gena i internog referentnog gena.U poređenju sa istim tkivom i istoj ćeliji, uticaj veličine uzorka, količine ekstrakcije RNK, efikasnosti reverzne transkripcije i efikasnosti PCR-a je relativno mali.Zbog male veličine uzorka, i interni referentni geni i ciljni geni su relativno smanjeni.Zbog toga smo ranije naglašavali uniformnost i stabilnost.
Unutrašnji referentni geni su generalnodomaćinski geni(domaćinski geni), koji se odnose na klasu gena koji su stabilno eksprimirani u svim ćelijama, a njihovi proizvodi su neophodni za održavanje osnovnih životnih aktivnosti ćelija.
Nemojte brkati ovaj koncept.Geni za održavanje kućanstva su termini biološke funkcije, dok su interni referentni geni eksperimentalni tehnički termini.Geni za održavanje kućanstva moraju proći validaciju prije nego što se mogu odabrati kao interni referentni geni.
Na primjer, odabrali smo nekoliko gena za održavanje kućanstva na donjoj slici kako bismo testirali nivoe njihove ekspresije u različitim ćelijama tkiva i otkrili da su nivoi ekspresije β-2-mikroglobulina prilično različiti od onih za ostala tri gena, tako da se ne mogu koristiti kao interni referentni geni.

Nakon razumijevanja funkcije korekcije internog referentnog gena, izvedena su dva algoritma zbog uvođenja internog referentnog gena.
·metoda dvostruke standardne krive
·2 – △△Ct metoda (metoda poređenja CT vrijednosti)
Ako ste zainteresovani za proučavanje vrsta i funkcija gena, molimo vas da odustanete od istraživanja algoritama i direktno koristite formule ili direktno koristite mašine;ako ste strejt tip u matematici i inženjerstvu, slobodno.
metoda dvostrukih standardnih krivulja
Kvantifikujte ciljni gen i gen za održavanje domaćinstva kontrolnog uzorka i uzorka koji se testira kroz standardnu ​​krivu, a zatim izračunajte relativnu vrednost prema formuli za izračunavanje, što je relativni nivo ekspresije.
Prednosti: jednostavna analiza, relativno jednostavna eksperimentalna optimizacija
Nedostatak: Za svaki gen, svaki krug eksperimenata mora napraviti standardnu ​​krivu
Primjena: Jedna od dvije najčešće korištene i priznate relativne kvantitativne metode u proučavanju regulacije ekspresije gena
Formula je sljedeća:

Primjeri su sljedeći:

Izračunajte relativni iznos na osnovu kvantitativnog rezultata
2 – △△Ct metoda (metoda poređenja CT vrijednosti)

Prednosti: Nema potrebe za pravljenjem standardne krive
Nedostaci: Pretpostavlja se da je efikasnost amplifikacije blizu 100%;standardna devijacija je < 5%, a pretpostavlja se da su standardna kriva i efikasnost između svakog pojačanja konzistentne;optimizacija eksperimentalnih uslova je komplikovanija.
Primjena: Jedna od dvije najčešće korištene i priznate relativne kvantitativne metode u proučavanju regulacije ekspresije gena

Naravno, efikasnost amplifikacije obično je nemoguće da bude savršena 1. Metoda korekcije: Ako znamo da ciljni gen i referentni gen imaju istu efikasnost amplifikacije, ali efikasnost amplifikacije nije jednaka 1, tada se 2－△△Ct može ispraviti kao: (1+E )－△△Ct, na primjer, formula amplifikacije može biti ispravna 0,9, ako je 0,19, ako je formula 0,9 tačna. 5－△△Ct
Do sada je sadržaj o fluorescentnom kvantitativnom PCR-u došao do kraja.