Objašnjenje osnovnih pojmova molekularne biologije
1. cDNK i cccDNA: cDNK je dvolančana DNK sintetizirana reverznom transkriptazom iz mRNA;cccDNA je plazmid dvolančana zatvorena kružna DNK bez hromozoma.
2. Standardna sklopiva jedinica: jedinica sekundarne strukture proteina α-heliks i β-list mogu formirati strukturne blokove sa posebnim geometrijskim rasporedom kroz različite polipeptide za povezivanje.Ova vrsta utvrđenog savijanja obično se naziva super sekundarna struktura.Gotovo sve tercijarne strukture mogu se opisati ovim tipovima preklapanja, pa čak i njihovim kombinovanim tipovima, pa se nazivaju i standardnim sklopivim jedinicama.
3. CAP: ciklički adenozin monofosfat (cAMP) receptor protein CRP (cAMP receptor protein), kompleks nastao nakon kombinacije cAMP i CRP naziva se aktivirajući protein CAP (cAMP aktivirani protein)
4. Palindromska sekvenca: Reverzna komplementarna sekvenca segmenta fragmenta DNK, često mjesto restrikcijskog enzima.
5. micRNA: Komplementarna interferirajuća RNK ili antisens RNK, koja je komplementarna sekvenci mRNA i može inhibirati translaciju mRNA.
6. Ribozim: RNK sa katalitičkom aktivnošću, koja igra autokatalitičku ulogu u procesu spajanja RNK.
7. Motiv: Postoje neke lokalne regije sa sličnim trodimenzionalnim oblikom i topologijom u prostornoj strukturi proteinskih molekula
8. Signalni peptid: peptid sa 15-36 aminokiselinskih ostataka na N-kraju tokom sinteze proteina, koji vodi transmembranu proteina.
9. Attenuator: Nukleotidna sekvenca između regiona operatora i strukturnog gena koji završava transkripciju.
10. Čarobna tačka: Kada bakterija raste i naiđe na potpuni nedostatak aminokiselina, bakterije će proizvesti hitan odgovor kako bi zaustavile ekspresiju svih gena.Signali koji stvaraju ovaj hitni odgovor su gvanozin tetrafosfat (ppGpp) i guanozin pentafosfat (pppGpp).Uloga PpGpp i pppGpp nije samo jedan ili nekoliko operona, već utiče na veliki broj njih, pa se nazivaju superregulatori ili magične tačke.
11. Uzvodni promotorski element: odnosi se na sekvencu DNK koja igra regulatornu ulogu u aktivnosti promotora, kao što je TATA u -10 regiji, TGACA u -35 regiji, pojačivači i atenuatori.
12. DNK sonda: označeni segment DNK sa poznatom sekvencom, koja se široko koristi za otkrivanje nepoznatih sekvenci i skrining ciljnih gena.
13. SD sekvenca: To je vezujuća sekvenca ribozoma i mRNA, koja reguliše translaciju.
14. Monoklonsko antitelo: Antitelo koje deluje samo protiv jedne antigene determinante.
15. Kosmid: To je veštački konstruisan egzogeni DNK vektor koji zadržava COS regione na oba kraja faga i povezan je sa plazmidom.
16. Skrining plavo-bijele mrlje: LacZ gen (koji kodira β-galaktozidazu), enzim može razgraditi hromogeni supstrat X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indol-β-D-galaktozid) da bi proizveo plavu, čineći tako soj plavim.Kada se ubaci egzogena DNK, LacZ gen se ne može eksprimirati, a soj je bijel, kako bi se pregledale rekombinantne bakterije.To se zove plavo-bijeli skrining.
17. Cis-djelujući element: Specifična sekvenca baza u DNK koja reguliše ekspresiju gena.
18. Klenow enzim: Veliki fragment DNK polimeraze I, osim što je aktivnost 5' 3' egzonukleaze uklonjena iz holoenzima DNK polimeraze I
19. Usidreni PCR: koristi se za amplifikaciju DNK od interesa sa poznatom sekvencom na jednom kraju.Poli-dG rep je dodat na jedan kraj nepoznate sekvence, a zatim su poli-dC i poznata sekvenca korišćeni kao prajmeri za PCR amplifikaciju.
20. Fuzioni protein: Gen eukariotskog proteina je povezan sa egzogenim genom, a protein koji se sastoji od translacije originalnog genskog proteina i egzogenog proteina se eksprimira istovremeno.
Drugi termini molekularne biologije
1. Fizička mapa DNK je redoslijed u kojem su (restrikcionom endonukleazom probavljeni) fragmenti molekula DNK raspoređeni.
2. Cepanje RNaze se deli na dva tipa (autokataliza) i (heterokataliza).
3. Postoje tri inicijaciona faktora kod prokariota su (IF-1), (IF-2) i (IF-3).
4. Transmembranski proteini zahtijevaju vođenje (signalni peptidi), a uloga proteinskih šaperona je (pomaže u savijanju peptidnog lanca u nativnu konformaciju proteina).
5. Elementi u promotorima se generalno mogu podijeliti u dva tipa: (elementi promotora jezgre) i (uzvodni promotorski elementi).
6. Istraživački sadržaj molekularne biologije uglavnom uključuje tri dijela: (strukturna molekularna biologija), (ekspresija i regulacija gena) i (tehnologija rekombinacije DNK).
7. Dva ključna eksperimenta koja pokazuju da je DNK genetski materijal su (pneumokokna infekcija miševa) i (infekcija T2 fagom Escherichia coli).potencijal).
8. Postoje dvije glavne razlike između hnRNA i mRNA: (hnRNA se spaja u procesu pretvaranja u mRNA), (5' kraj mRNA se dodaje sa m7pGppp kapom, a postoji dodatna poliadenilacija na 3' kraju mRNA kiselog (poliA) repa).
9. Prednosti oblika proteina sa više podjedinica su (podjedinica je ekonomična metoda za korišćenje DNK), (može smanjiti uticaj slučajnih grešaka u sintezi proteina na aktivnost proteina), (aktivnost može biti veoma efikasno i brzo se otvara i zatvara).
10. Glavni sadržaj mehanizma savijanja proteina prva teorija nukleacije uključuje (nukleaciju), (strukturno obogaćivanje), (konačno preuređenje).
11. Galaktoza ima dvostruki efekat na bakterije;s jedne strane (može se koristiti kao izvor ugljika za rast stanica);s druge strane (takođe je komponenta ćelijskog zida).Stoga je za trajnu sintezu na pozadinskom nivou potreban cAMP-CRP-nezavisan promotor S2;u isto vrijeme, cAMP-CRP ovisan promotor S1 je neophodan za regulaciju sinteze visokog nivoa.Transkripcija počinje od (S2) sa G i od (S1) bez G.
12. Tehnologija rekombinantne DNK poznata je i kao (kloniranje gena) ili (molekularno kloniranje).Krajnji cilj je (prenošenje genetske informacije DNK iz jednog organizma u drugi organizam).Tipičan eksperiment rekombinacije DNK obično uključuje sljedeće korake: (1) Ekstrahirajte ciljni gen (ili egzogeni gen) donatorskog organizma i enzimski ga povežite s drugim molekulom DNK (vektor za kloniranje) kako bi se formirao novi rekombinantni DNK molekul.② Rekombinantni molekul DNK se prenosi u ćeliju primaoca i replicira u ćeliji primaocu.Ovaj proces se naziva transformacija.③ Pregledajte i identifikujte one ćelije primaoca koje su apsorbovale rekombinantnu DNK.④Kultivirajte ćelije koje sadrže rekombinantnu DNK u velikim količinama kako biste otkrili da li je eksprimiran gen za stranu pomoć.
13. Postoje dva tipa replikacije plazmida: oni koji su strogo kontrolirani sintezom proteina ćelije domaćina nazivaju se (uski plazmidi), a oni koji nisu strogo kontrolirani sintezom proteina ćelije domaćina nazivaju se (opušteni plazmidi).
14. PCR reakcioni sistem treba da ima sledeće uslove: a.DNK prajmeri (oko 20 baza) sa komplementarnim sekvencama na svakom kraju dva lanca ciljnog gena koji se razdvajaju.b.Enzimi sa termičkom stabilnošću kao što su: TagDNA polimeraza.c, dNTPd, DNK sekvenca od interesa kao šablon
15. Osnovni reakcioni proces PCR uključuje tri faze: (denaturacija), (žarenje) i (ekstenzija).
16. Osnovni proces transgenih životinja obično uključuje: ①Uvođenje kloniranog stranog gena u jezgro oplođenog jajeta ili embrionalne matične ćelije;②Transplantacija inokuliranog oplođenog jajeta ili embrionalne matične ćelije u žensku matericu;③Kompletan embrionalni razvoj i rast Za potomstvo sa stranim genima;④ Koristite ove životinje koje mogu proizvesti strane proteine kao rasplodnu stoku za uzgoj novih homozigotnih linija.
17. Hibridomske ćelijske linije nastaju hibridizacijom (B slezena) ćelija sa (mijelom) ćelijama, a pošto (ćelije slezene) mogu da koriste hipoksantin i (ćelije kostiju) obezbeđuju funkcije deobe ćelija, mogu se uzgajati u HAT medijumu.rasti.
18. Produbljivanjem istraživanja prva generacija antitela naziva se (poliklonska antitela), druga generacija (monoklonska antitela), a treća generacija (antitela genetskog inženjeringa).
19. Trenutno je genetski inženjering virusa insekata uglavnom fokusiran na bakulovirus, koji se manifestuje unošenjem (gena egzogenog toksina);(geni koji remete normalan životni ciklus insekata);(modifikacija virusnih gena).
20. Trans-djelujući proteinski faktori koji odgovaraju zajedničkim elementima TATA, GC i CAAT u promotoru RNK polimeraze II sisara su (TFIID), (SP-1) i (CTF/NF1), respektivno.
dvadeset jedan.Osnovni faktori transkripcije RNK polimeraze Ⅱ su TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E, a sekvenca njihovog vezivanja je: (D, A, B, E).Pri čemu je funkcija TFII-D (vezivanje za TATA kutiju).
dvadeset dva.Većina faktora transkripcije koji se vezuju za DNK rade u obliku dimera.Funkcionalni domeni faktora transkripcije koji se vezuju za DNK su obično sljedeći (helix-turn-helix), (motiv cink prsta), (osnovni-leucin) rajsferšlus motiv).
dvadeset tri.Postoje tri vrste načina cijepanja restrikcijske endonukleaze: (rezati na 5' strani ose simetrije da bi se generirali 5' ljepljivi krajevi), (rezati na 3' strani ose simetrije da bi se generirali 3' ljepljivi krajevi (rezati na osi simetrije da bi se generirali ravni segmenti)).
dvadeset četiri.Plazmidna DNK ima tri različite konfiguracije: (SC konfiguracija), (oc konfiguracija), (L konfiguracija).Prvi u elektroforezi je (SC konfiguracija).
25. Sistemi egzogene ekspresije gena, uglavnom (Escherichia coli), (kvasac), (Insekt) i (tabela ćelija sisara).
26. Metode koje se najčešće koriste za transgene životinje su: (metoda retrovirusne infekcije), (metoda mikroinjekcije DNK), (metoda embrionalnih matičnih ćelija).
Primjena Molekularna biologija
1. Navedite funkcije više od 5 RNK?
Transfer RNA tRNA Prijenos aminokiseline Ribosom RNA rRNA Ribosom čini komponente RNK mRNA mRNA Predložak sinteze proteina Heterogena nuklearna RNA hnRNA Prekursor zrele mRNA mala nuklearna RNA snRNA Uključena u spajanje hnRNA Mala citoplazmatska RNA scRNA/7SL-tična RNA signalizirani protein Plaogni sintetički regenerirani protein tijela RNA anRNA/micRNA Reguliše ekspresiju gena Ribozyme RNA Enzimski aktivna RNK
2. Koja je glavna razlika između prokariotskih i eukariotskih promotora?
Prokariotski TTGACA --- TATAAT------Inicijacijsko mjesto-35 -10 Eukariotski pojačivač---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Inicijacijsko mjesto-110 -70 -25
3. Koji su glavni aspekti vještačke konstrukcije prirodnih plazmida?
Prirodni plazmidi često imaju defekte, tako da nisu pogodni za upotrebu kao nosioci genetskog inženjeringa i moraju biti modifikovani i konstruisani: a.Dodajte odgovarajuće gene za selekciju markera, kao što su dva ili više, koji se lako koriste za selekciju, obično antibiotske gene.b.Povećajte ili smanjite odgovarajuća mjesta rezanja enzima kako biste olakšali rekombinaciju.c.Skratite dužinu, odrežite nepotrebne fragmente, poboljšajte efikasnost uvoza i povećajte kapacitet utovara.d.Promijenite replikon, iz čvrstog u labav, s manje kopija na više kopija.e.Dodajte posebne genetske elemente prema posebnim zahtjevima genetskog inženjeringa
4. Navedite primjer metode za diferencijalni skrining tkivno specifične cDNK?
Pripremljene su dvije populacije stanica, ciljni gen je eksprimiran ili visoko eksprimiran u jednoj od stanica, a ciljni gen nije eksprimiran ili slabo eksprimiran u drugoj ćeliji, a zatim se hibridizacijom i poređenjem pronađe ciljni gen.Na primjer, tokom pojave i razvoja tumora, tumorske ćelije će predstaviti mRNA sa različitim nivoima ekspresije od normalnih ćelija.Stoga se geni povezani s tumorom mogu skrinirati diferencijalnom hibridizacijom.Metoda indukcije se također može koristiti za skrining gena čija je ekspresija inducirana.
5. Generisanje i skrining ćelijskih linija hibridoma?
B ćelije slezene + ćelije mijeloma, dodajte polietilen glikol (PEG) za promociju fuzije ćelija, a fuzione ćelije B-mijeloma slezene uzgajane u HAT medijumu (koji sadrži hipoksantin, aminopterin, T) nastavljaju da šire hranu.Stanična fuzija sadrži: fuzione ćelije slezene i slezene: ne mogu rasti, ćelije slezene se ne mogu uzgajati in vitro.Koštano-koštane fuzijske ćelije: ne mogu iskoristiti hipoksantin, ali mogu sintetizirati purin kroz drugi put koristeći folat reduktazu.Aminopterin inhibira folat reduktazu i stoga ne može rasti.Stanice fuzije kosti-slezena: mogu rasti u HAT-u, stanice slezene mogu koristiti hipoksantin, a stanice kostiju pružaju funkciju diobe stanica.
6. Koji je princip i način određivanja primarne strukture DNK metodom dideoksi terminalne terminacije (Sanger metoda)?
Princip je korištenje terminatora nukleotidnog lanca—2,,3,-dideoksinukleotida da se prekine produžetak DNK.Pošto mu nedostaje 3-OH potreban za formiranje 3/5/fosfodiestarskih veza, kada se jednom ugradi u lanac DNK, lanac DNK se ne može dalje produžiti.Prema principu uparivanja baza, kad god je DNK polimerazi potreban dNMP da učestvuje u normalno produženom DNK lancu, postoje dve mogućnosti, jedna je da učestvuje u ddNTP, što rezultira prekidom produžetka deoksinukleotidnog lanca;drugi je da učestvuje u dNTP, tako da lanac DNK i dalje može da nastavi da se produžava dok se sledeći ddNTP ne ugradi.Ovom metodom može se dobiti grupa fragmenata DNK različitih dužina koji završavaju ddNTP.Metoda je podjela u četiri grupe, odnosno ddAMP, ddGMP, ddCMP i ddTMP.Nakon reakcije, elektroforeza u poliakrilamidnom gelu može očitati DNK sekvencu prema plivajućim trakama.
7. Kakav je pozitivan regulacijski efekat aktivatorskog proteina (CAP) na transkripciju?
Protein cikličkog adenilata (cAMP) receptora CRP (cAMP receptor protein), kompleks nastao kombinacijom cAMP i CRP naziva se CAP (cAMP aktivirani protein).Kada se E. coli uzgaja u mediju bez glukoze, povećava se sinteza CAP, a CAP ima funkciju aktiviranja promotora kao što je laktoza (Lac).Nekim promotorima zavisnim od CRP nedostaje tipična karakteristika sekvence regiona -35 (TTGACA) koju imaju uobičajeni promotori.Stoga je RNK polimerazi teško da se veže za nju.Prisustvo CAP (funkcije): može značajno poboljšati konstantu vezivanja enzima i promotora.Uglavnom pokazuje sljedeća dva aspekta: ① CAP pomaže molekuli enzima da se pravilno orijentira promjenom konformacije promotora i interakcije sa enzimom, tako da se kombinuje s regijom -10 i igra ulogu zamjene funkcije regije -35.②CAP takođe može inhibirati vezivanje RNA polimeraze za druga mesta u DNK, čime se povećava verovatnoća vezivanja za njen specifični promotor.
8. Koji koraci se obično uključuju u tipičan eksperiment rekombinacije DNK?
a.Ekstrahirajte ciljni gen (ili egzogeni gen) donatorskog organizma i enzimski ga povežite s drugim molekulom DNK (vektorom za kloniranje) kako bi se formirao novi rekombinantni DNK molekul.b.Prenesite rekombinantnu DNK molekulu u ćeliju primaoca i replicirajte je i sačuvajte u ćeliji primaocu.Ovaj proces se naziva transformacija.c.Pregledajte i identifikujte one ćelije primaoca koje su apsorbovale rekombinantnu DNK.d.Masovna kultura ćelija koje sadrže rekombinantnu DNK da bi se otkrilo da li je eksprimiran gen za stranu pomoć.
9. Konstrukcija biblioteke gena Date su tri metode za skrining rekombinanata i proces je ukratko opisan.
Skrining rezistencije na antibiotike, inserciona inaktivacija rezistencije, skrining plavo-bijele mrlje ili PCR skrining, diferencijalni skrining, DNK sonda Većina vektora za kloniranje nosi gene otpornosti na antibiotike (anti-ampicilin, tetraciklin).Kada se plazmid prenese u Escherichia coli, bakterije će steći otpornost, a one bez prijenosa neće imati otpor.Ali ne može razlikovati da li je reorganizovan ili ne.U vektoru koji sadrži dva gena otpornosti, ako je strani fragment DNK umetnut u jedan od gena i uzrokuje inaktivaciju gena, dvije kontrole ploče koje sadrže različite lijekove mogu se koristiti za skrining pozitivnih rekombinanata.Na primjer, plazmid pUC sadrži LacZ gen (kodira β-galaktozidazu), koji može razgraditi kromogeni supstrat X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indol-β-D-galaktozid) da bi proizveo plavu boju, pretvarajući tako soj u plavo.Kada se ubaci strana DNK, LacZ gen se ne može eksprimirati, a soj je bijel, kako bi se pregledale rekombinantne bakterije.
10. Objasnite osnovni proces dobijanja transgenih životinja putem embrionalnih matičnih ćelija?
Embrionalne matične ćelije (ES) su embrionalne ćelije tokom embrionalnog razvoja, koje se mogu veštački uzgajati i razmnožavati i imaju funkciju diferencijacije u druge tipove ćelija.Kultura ES ćelija: Unutrašnja ćelijska masa blastociste se izoluje i uzgaja.Kada se ES uzgaja u sloju bez hranilice, on će se diferencirati u različite funkcionalne ćelije kao što su mišićne ćelije i N ćelije.Kada se uzgaja u mediju koji sadrži fibroblaste, ES će održati funkciju diferencijacije.ES se može genetski manipulirati, a njegova funkcija diferencijacije može se integrirati bez utjecaja na njegovu funkciju diferencijacije, što rješava problem slučajne integracije.Uvesti egzogene gene u embrionalne matične ćelije, zatim implantirati u matericu trudnih ženki miševa, razviti se u mladunčad i ukrstiti kako bi se dobili homozigotni miševi.
