Nema pojačanja signala

1.Taq DNK polimeraza u kompletu gubi svoju aktivnost zbog nepravilnog skladištenja ili isteka kompleta.
Preporuka: Potvrdite uslove skladištenja kompleta;ponovo dodajte odgovarajuću količinu Taq DNK polimeraze u PCR sistem ili kupite novi komplet za PCR u realnom vremenu za povezane eksperimente.

2. Postoji mnogo inhibitora Taq DNK polimeraze u DNK šablonu.
Prijedlog: Pročistite šablon ili smanjite količinu korištenog šablona.

3. Koncentracija Mg2+ nije prikladna.
Preporuka: Koncentracija Mg2+ u 2× Real PCR mješavini koju pružamo je 3,5 mM.Međutim, za neke posebne prajmere i šablone, koncentracija Mg2+ može biti veća.Stoga možete direktno dodati MgCl2 kako biste optimizirali koncentraciju Mg2+.Preporučuje se povećanje Mg2+ za 0,5mM svaki put radi optimizacije.

4. Uslovi PCR amplifikacije nisu prikladni, a sekvenca prajmera ili koncentracija je neodgovarajuća.
Prijedlog: potvrdite ispravnost sekvence prajmera i prajmer nije degradiran;ako signal pojačanja nije dobar, pokušajte sniziti temperaturu žarenja i na odgovarajući način prilagoditi koncentraciju prajmera.

5. Količina šablona je premala ili prevelika.
Preporuka: Izvršite razblaživanje gradijentom linearizacije šablona i izaberite koncentraciju šablona sa najboljim PCR efektom za PCR eksperiment u realnom vremenu.

NTC ima previsoku vrijednost fluorescencije

1. Kontaminacija reagensom uzrokovana tokom rada.
Preporuka: Zamijenite novim reagensima za PCR eksperimente u realnom vremenu.

2. Do kontaminacije je došlo tokom pripreme PCR reakcijskog sistema.
Preporuka: Poduzmite potrebne zaštitne mjere tokom rada, kao što su: nošenje rukavica od lateksa, korištenje vrha pipete sa filterom itd.

3. Prajmeri su degradirani, a degradacija prajmera će uzrokovati nespecifično pojačanje.
Prijedlog: Koristite SDS-PAGE elektroforezu da otkrijete da li su prajmeri degradirani i zamijenite ih novim prajmerima za PCR eksperimente u realnom vremenu.

Dimer prajmera ili nespecifična amplifikacija

1. Koncentracija Mg2+ nije prikladna.
Preporuka: Koncentracija Mg2+ 2× Real PCR EasyTM mješavine koju nudimo je 3,5 mM.Međutim, za neke posebne prajmere i šablone, koncentracija Mg2+ može biti veća.Stoga možete direktno dodati MgCl2 kako biste optimizirali koncentraciju Mg2+.Preporučuje se povećanje Mg2+ za 0,5mM svaki put radi optimizacije.

2. Temperatura PCR žarenja je preniska.
Prijedlog: Svaki put povećajte temperaturu PCR žarenja za 1℃ ili 2℃.

3. PCR proizvod je predugačak.
Preporuka: Dužina PCR proizvoda u realnom vremenu treba da bude između 100-150bp, ne više od 500bp.

4. Prajmeri su degradirani, a degradacija prajmera će dovesti do pojave specifične amplifikacije.
Prijedlog: Koristite SDS-PAGE elektroforezu da otkrijete da li su prajmeri degradirani i zamijenite ih novim prajmerima za PCR eksperimente u realnom vremenu.

5. PCR sistem je neispravan ili je sistem premali.
Prijedlog: PCR reakcijski sistem je premali, što će uzrokovati smanjenje tačnosti detekcije.Najbolje je koristiti sistem reakcije koji preporučuje kvantitativni PCR instrument za ponovno izvođenje PCR eksperimenta u realnom vremenu.

Slaba ponovljivost kvantitativnih vrijednosti

1. Instrument je neispravan.
Prijedlog: Može postojati greške između svake PCR rupe na instrumentu, što rezultira lošom ponovljivošću tokom upravljanja temperaturom ili detekcije.Molimo provjerite prema uputama odgovarajućeg instrumenta.

2. Čistoća uzorka nije dobra.
Preporuka: Nečisti uzorci će dovesti do loše ponovljivosti eksperimenta, što uključuje čistoću šablona i prajmera.Najbolje je ponovo pročistiti šablon, a prajmeri se najbolje pročišćavaju pomoću SDS-PAGE.

3. Vrijeme pripreme i skladištenja PCR sistema je predugo.
Preporuka: Koristite PCR sistem u realnom vremenu za PCR eksperiment odmah nakon pripreme i ne ostavljajte ga predugo po strani.

4. Uslovi PCR amplifikacije nisu prikladni, a sekvenca prajmera ili koncentracija je neodgovarajuća.
Prijedlog: potvrdite ispravnost sekvence prajmera i prajmer nije degradiran;ako signal pojačanja nije dobar, pokušajte sniziti temperaturu žarenja i na odgovarajući način prilagoditi koncentraciju prajmera.

5. PCR sistem je neispravan ili je sistem premali.
Prijedlog: PCR reakcijski sistem je premali, što će uzrokovati smanjenje tačnosti detekcije.Najbolje je koristiti sistem reakcije koji preporučuje kvantitativni PCR instrument za ponovno izvođenje PCR eksperimenta u realnom vremenu.