Escherichia Coli O157: H7 komplet za detekciju nukleinske kiseline (PCR metoda fluorescentne sonde/liofilizacija)
Opis kompleta:
Kat.br.FP103
Koristi se za brzo otkrivanje i skrining E. coli O157:H7 u uzorcima hrane, hrane, vode i okoliša.
Opisi
Koristi se zabrzo otkrivanje i skrining E. coli O157:H7 u uzorcima hrane, hrane, vode i okoliša.
[Princip testiranja]
Prema principu fluorescentne PCR tehnologije, specifični prajmeri i Taqman sonde su dizajnirani za specifični gen Escherichia coli O157: H7, a detektovani su fluorescentnim PCR instrumentom, kako bi se realizovala detekcija Escherichia coli O157: H7 Kvalitativna detekcija DNK.
Sadržaj kompleta
Napomena: ROX kanalna sonda nije uključena.
| Ckomponente | Specifikacija | Qjedinstvo |
| Pufer A | Tube | 1 |
| Pufer B | Tube | 1 |
| Pozitivna kontrola | Tube | 1 |
| Negativna kontrola | Tube | 1 |
Očekivana upotreba
Koristi se za brzo otkrivanje i skrining E. coli O157:H7 u uzorcima hrane, hrane, vode i okoliša.
Uslovi skladištenja i rok trajanja
Čuvati na -20℃ u mraku i izbjegavati ponovno zamrzavanje i odmrzavanje.
Rok važenja je 12mjeseci, a datum proizvodnje je prikazan na vanjskom pakovanju.
Instrumenti i potrošni materijal
Fluorescentni kvantitativni PCR instrument, pipeta pištolj i odgovarajući vrhovi, vortex shaker, mini centrifuga.
Upotreba
1. Obrada uzorka
1.1 Tip uzorka: Ovaj komplet je pogodan za uzorke hrane, hrane, vode i drugih uzoraka za koje se sumnja da su kontaminirani Escherichia coli O157:H7.Za duboko obrađene mesne proizvode, pića i druge supstance koje sadrže pigmente, potrebno ih je isprati kako bi se izbjeglo utjecaj na prikupljanje fluorescentnog signala.
1.2 Obrada uzoraka: Pogledajte "GB 4789.10-2016 Nacionalni standardni standard za mikrobiološko ispitivanje hrane Escherichia coli O157: H7 Test" za pripremu uzorka, kulturu obogaćivanja i izolaciju Escherichia coli O157: H7.
- Nekstrakcija ukleinske kiseline
Uzmite 20 mL otopine za obogaćivanje u epruvetu za centrifugiranje od 1,5 mL, dodajte 200 μL mikrobnog lizata (potreban je dodatni pribor), vorteksirajte 30 sekundi, kratko centrifugirajte i ostavite sa strane.
Napomene: Ekstrakcija nukleinske kiseline iz lizata treba da se završi u roku od 10 minuta i ne može se čuvati duže vreme.
3. Amplifikacija nukleinske kiseline
3.1 Uključite fluorescentni kvantitativni PCR instrument za upotrebu.
Pufer A i pufer B iz kompleta, dobro ih otopite i kratko centrifugirajte.Dodajte 18 μL pufera A i 2 μL pufera B u svaku PCR reakcijsku epruvetu.Zatim dodajte po 5 mL svake negativne kontrole, ekstrahirane nukleinske kiseline i pozitivne kontrole u epruvete za PCR reakciju, zatvorite epruvete i kratko centrifugirajte.
3.3 Prenesite PCR reakcijsku epruvetu u fluorescentnu PCR mašinu i koristite sledeće procedure za izvođenje eksperimenata amplifikacije: izaberite 25 mL za reakcioni sistem, sakupite fluorescentne signale na 60°C za svaki ciklus i izaberite FAM za kanal za detekciju.
| Korak | Program | Broj ciklusa |
| 1 | 37℃ 5min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60℃ 30s (prikupiti fluorescenciju) |
Vodiči za analizu problema
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
RNK se ne može ekstrahovati ili je prinos nukleinske kiseline nizak
Obično postoji mnogo faktora koji utiču na efikasnost oporavka, kao što su: sadržaj RNK uzorka, način rada, zapremina eluiranja, itd.
Analiza uobičajenih uzroka:
1.Ledeno kupatilo ili centrifugiranje na niskoj temperaturi (4°C) tokom rada.
Preporuka: Rad na sobnoj temperaturi (15-25°C), nikada ledena kupka i niskotemperaturna centrifuga.
2. Nepravilno skladištenje uzoraka ili skladištenje uzoraka predugo.
Preporuka: Čuvajte uzorke na -80 °C ili zamrznite u tekućem dušiku i izbjegavajte ponovnu upotrebu zamrzavanja-odmrzavanja;pokušajte koristiti svježe prikupljene uzorke za ekstrakciju RNK.
3.Nedovoljna liza uzorka
Preporuka: Uvjerite se da su uzorak i radna otopina (linearni akrilamid) temeljito pomiješani i inkubirani 10 minuta na sobnoj temperaturi (15-25 °C)
4.Eluent je dodan pogrešno
Preporuka: Uvjerite se da je ddH2O bez RNase dodat u sredinu membrane kolone za pročišćavanje
5. Neodgovarajuća zapremina bezvodnog etanola u puferu viRW2
Prijedlog: Molimo slijedite upute, dodajte odgovarajuću količinu bezvodnog etanola u Puffer viRW2 i dobro ih promiješajte prije upotrebe kompleta.
6. Nepravilna upotreba uzorka.
Preporuka: 200µl uzorka na 500µl Buffer viRL.Prevelik volumen uzorka će rezultirati smanjenom stopom ekstrakcije RNK.
7. Nepravilan volumen eluiranja ili nepotpuno eluiranje.
Preporuka: Volumen eluenta kolone za prečišćavanje je 30-50μl;ako efekat eluiranja nije zadovoljavajući, preporučuje se dodavanje prethodno zagrijanog ddH bez RNase2O i produžite vrijeme stavljanja na sobnu temperaturu, kao što je 5-10 min
8. Kolona za prečišćavanje ima ostatke etanola nakon ispiranja u puferu viRW2.
Preporuka: Ako etanol i dalje ostaje nakon ispiranja u puferu viRW2 i centrifugiranja prazne epruvete u trajanju od 2 minute, kolona za pročišćavanje može se ostaviti na sobnoj temperaturi 5 minuta nakon centrifugiranja u praznoj epruveti kako bi se u potpunosti uklonio preostali etanol.
Degradacija pročišćenih RNA molekula
Kvalitet pročišćene RNK povezan je s faktorima kao što su skladištenje uzoraka, kontaminacija RNK-azom i rad.
Analiza uobičajenih uzroka:
1. Prikupljeni uzorci nisu sačuvani na vrijeme.
Preporuka: Ako se uzorak ne iskoristi na vrijeme nakon sakupljanja, odmah ga pohranite na -80 ℃ ili tečnom dušiku.Za ekstrakciju RNA molekula pokušajte koristiti svježe sakupljene uzorke kad god je to moguće.
2. Prikupljeni uzorci su se više puta smrzavali i odmrzavali.
Preporuka: Izbjegavajte ponovno zamrzavanje i odmrzavanje (ne više od jednom) tokom prikupljanja i skladištenja uzoraka, inače će se smanjiti prinos nukleinske kiseline.
3.RNase je uvedena u operacionu salu ili se nisu nosile jednokratne rukavice, maske i sl.
Prijedlog: Eksperiment ekstrakcije RNA molekula najbolje je izvesti u posebnoj RNA operacijskoj sali, a eksperimentalni sto se očisti prije eksperimenta.Nosite rukavice i maske za jednokratnu upotrebu tokom eksperimenta kako biste izbjegli degradaciju RNK uzrokovanu uvođenjem RNase.
4. Reagens je kontaminiran RNazom tokom upotrebe.
Prijedlog: Zamijenite novim kompletom za izolaciju virusne RNK za povezane eksperimente.
5. Kontaminacija centrifugalnih epruveta, vrhova pipeta, itd. RNase. Predlog: Uverite se da su epruvete za centrifugiranje, vrhovi pipete i pipete bez RNaze.
Pročišćeni RNA molekuli utjecali su na nizvodne eksperimente
Molekuli RNK pročišćeni kolonom za pročišćavanje će utjecati na nizvodne eksperimente ako ima previše jona soli ili proteina, kao što su: reverzna transkripcija, Northern blot, itd.。
1. Postoje preostali joni soli u eluiranim RNA molekulima.
Preporuka: Uvjerite se da je u pufer viRW2 dodan ispravan volumen bezvodnog etanola i dvaput operite kolonu za pročišćavanje prema ispravnoj brzini centrifugiranja u uputama za upotrebu; Ako još ima jona soli, možete dodati pufer viRW2 u kolonu za pročišćavanje i ostaviti je na sobnoj temperaturi 5 min.Zatim izvršite centrifugiranje kako biste u najvećoj mjeri uklonili kontaminaciju ionima soli
2. U eluiranim RNA molekulima ima preostalog etanola
Prijedlog: nakon što potvrdite da su kolone za prečišćavanje isprane Bufferom viRW2, izvršite centrifugiranje prazne epruvete prema brzini centrifuge u uputama za upotrebu.Ako još uvijek ima preostalog etanola, može se ostaviti 5 minuta na sobnoj temperaturi nakon centrifugiranja u praznoj epruveti kako bi se u najvećoj mjeri uklonio preostali etanol.
Uputstva za upotrebu:
Priručnik za upotrebu kompleta za izolaciju virusne RNA
