Dobro je poznato da je u središnjoj dogmi RNA transkripcijski posrednik između ekspresije DNK i proteina.U poređenju sa detekcijom DNK, detekcija RNK može objektivnije odražavati ekspresiju gena u organizmima.Eksperimenti koji uključuju RNK uključuju: qRT-PCR, RNA-Seq i detekciju fuzionih gena, itd. Na osnovu karakteristika same RNK (šećerni prsten RNK ima jednu slobodnu hidroksilnu grupu više od šećernog prstena DNK), zajedno sa velikim brojem RNaza u okruženju, RNK je nestabilnija i lakša za razgradnju.Smeće unutra, smeće van, ako kvalitet RNK nije dobar, onda eksperimentalni rezultati moraju biti nezadovoljavajući, posebno se manifestuju kao netačni podaci ili loša ponovljivost.Stoga je potrebno više pažnje posvetiti obradi RNK, a važnija je i veza kontrole kvaliteta kako bi se osigurala preciznost i tačnost naknadnih eksperimentalnih podataka.

Za kontrolu kvaliteta RNK općenito se koriste sljedeće metode:

• Spektrofotometrija
• elektroforeza u agaroznom gelu
• Agilent Bioanalyzer
• fluorescentni kvantitativni PCR u realnom vremenu
• Qubit metoda fluorescentne boje

01 Spektrofotometrija

RNK ima konjugirane dvostruke veze i ima apsorpcijski vrh na talasnoj dužini od 260 nm.Prema Lambert-Beerovom zakonu, možemo izračunati koncentraciju RNK iz apsorpcionog maksimuma na 260nm.Osim toga, možemo izračunati i čistoću RNK prema omjeru apsorpcionih pikova 260nm, 280nm i 230nm.280nm i 230nm su apsorpcijski vrhovi proteina i malih molekula, respektivno.Odnos A260/A280 i A260/A230 kvalifikovane čistoće RNK treba da bude veći od 2. Ako je manji od 2, to znači da postoji kontaminacija proteinom ili malim molekulima u uzorku RNK i da ga treba ponovo pročistiti.Izvori kontaminacije će uticati na nizvodne eksperimente, kao što je inhibiranje efikasnosti amplifikacije PCR reakcija, što će rezultirati netačnim kvantitativnim rezultatima.Čistoća RNK ima veliki utjecaj na naknadne rezultate, tako da je spektrofotometrija općenito nezamjenjiva karika kontrole kvaliteta u prvom koraku u eksperimentima s nukleinskim kiselinama.

Slika 1. Tipični spektar apsorpcije RNA/DNK

02 Elektroforeza u agaroznom gelu

Pored čistoće, integritet RNK je takođe jedan od važnih indikatora za procenu kvaliteta RNK.Degradacija RNK će dovesti do velikog broja kratkih fragmenata u uzorku, tako da će se smanjiti broj RNA fragmenata koji se mogu efikasno detektovati i pokriti referentnom sekvencom.Integritet RNK se može provjeriti elektroforezom ukupne RNK na 1% agaroznom gelu.Ovom metodom možete sami konfigurirati gel ili koristiti prefabrikovani E-Gel™ sistem za testiranje integriteta.Više od 80% ukupne RNK čini ribosomalna RNK, od kojih se većina sastoji od 28S i 18S rRNA (u sistemima sisara).RNK dobrog kvaliteta će pokazati dve očigledne svetle trake, a to su 28S i 18S svetle trake, respektivno, na 5 Kb i 2 Kb, a odnos će težiti da bude blizu 2:1.Ako je u difuznom stanju, to znači da je uzorak RNK možda degradiran, te se preporučuje korištenje metode opisane kasnije za dalje ispitivanje kvaliteta RNK.

Slika 2. Poređenje degradirane (traka 2) i intaktne RNK (traka 3) na elektroforezi u agaroznom gelu

03 Agilent Bioanalyzer

Pored gore opisane metode elektroforeze u agaroznom gelu, koja nam može pomoći da jednostavno i brzo identificiramo integritet RNK, možemo koristiti i Agilent bioanalizator za određivanje integriteta RNK.Koristi kombinaciju mikrofluidike, kapilarne elektroforeze i fluorescencije za procjenu koncentracije i integriteta RNK.Koristeći ugrađeni algoritam za analizu profila uzorka RNK, Agilent bioanalizator može izračunati referentnu vrijednost RNK integriteta, RNK Integrity Number (u daljem tekstu RIN) [1].Što je veća vrijednost RIN, to je veći integritet RNK (1 je ekstremno degradiran, 10 je najpotpuniji).Neki eksperimenti koji uključuju RNK predlažu korištenje RIN-a kao parametra za procjenu kvaliteta.Uzimajući za primjer eksperimente sekvencioniranja visoke propusnosti (u daljem tekstu NGS), smjernice Oncomine™ humanog imunološkog repertoara, koje se koriste za otkrivanje receptora antigena B ćelija i T ćelija u Thermo Fisherovoj Oncomine seriji panela, sugeriraju da se uzorci sa vrijednostima RIN većim od 4, mogu mjeriti efikasnije očitavanje 3 (slika 3).Postoje različiti preporučeni rasponi za različite panele, a često veći RIN može donijeti efikasnije podatke.

Slika 3, u eksperimentima Oncomine™ Human Immune Repertoire, uzorci sa RIN većim od 4 mogu otkriti efikasnije očitavanje i klonove T ćelija.【2】

Međutim, RIN vrijednost također ima neka ograničenja.Iako RIN ima visoku korelaciju sa kvalitetom NGS eksperimentalnih podataka, nije prikladan za FFPE uzorke.FFPE uzorci su hemijski tretirani dugo vremena, a ekstrahirana RNK općenito ima relativno nisku RIN vrijednost.Međutim, to ne znači da efektivni podaci eksperimenta moraju biti nezadovoljavajući.Da bismo precizno procijenili kvalitet FFPE uzoraka, moramo koristiti mjere koje nisu RIN.Pored RIN-a, Agilent bioanalizator takođe može izračunati vrijednost DV200 kao parametar evaluacije kvaliteta RNK.DV200 je parametar koji izračunava udio fragmenata većih od 200 bp u uzorku RNK.DV200 je bolji pokazatelj kvaliteta uzorka FFPE od RIN-a.Za RNK ekstrahiranu pomoću FFPE, ona ima vrlo visoku korelaciju sa brojem gena koji se mogu efikasno detektovati i raznovrsnošću gena [3].Iako DV200 može nadoknaditi nedostatke u detekciji kvaliteta FFPE, Agilent bioanalizator još uvijek ne može sveobuhvatno analizirati probleme kvalitete u RNA uzorcima, uključujući i to da li u uzorcima postoje inhibitori.Sami inhibitori mogu uticati na efikasnost amplifikacije eksperimenata u nastavku i smanjiti količinu korisnih podataka.Da bismo znali da li postoji inhibitor u uzorku, možemo usvojiti fluorescentnu kvantitativnu PCR metodu u realnom vremenu opisanu u nastavku.

04 fluorescentni kvantitativni PCR u realnom vremenu

Fluorescentna kvantitativna PCR metoda u realnom vremenu ne samo da može otkriti inhibitore u uzorku, već i precizno odražavati kvalitet RNK u FFPE uzorku.U poređenju sa Agilent biološkim analizatorima, kvantitativni instrumenti za fluorescenciju u realnom vremenu su popularniji u velikim biološkim laboratorijama zbog svoje šire primene.Da bismo testirali kvalitet uzoraka RNK, potrebno je samo da kupimo ili pripremimo prajmer sonde za interne referentne gene, kao što je GUSB (kat br. Hs00939627).Korišćenjem ovog skupa prajmera, sondi i standarda (ukupna RNK poznate koncentracije) za izvođenje apsolutnih kvantitativnih eksperimenata, efektivna koncentracija RNA fragmenta može se izračunati kao standard za evaluaciju kvaliteta RNK (kratko funkcionalna RNA kvantitacija (FRQ)).U NGS testu, otkrili smo da FRQ uzoraka RNK ima veoma visoku korelaciju sa efektivnim volumenom podataka.Za sve uzorke veće od 0,2 ng/uL FRQ, najmanje 70% očitavanja može efektivno pokriti referentnu sekvencu (slika 4).

Na slici 4, vrijednost FRQ detektirana kvantitativnom metodom fluorescencije ima vrlo visoku korelaciju (R2>0,9) sa efektivnim podacima dobijenim u NGS eksperimentu.Crvena linija je FRQ vrijednost jednaka 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

Osim što je primjenjiva na FFPE uzorke, kvantitativna PCR metoda u realnom vremenu također može efikasno pratiti inhibitore u uzorcima.Možemo dodati uzorak za detekciju u reakcioni sistem sa internom pozitivnom kontrolom (IPC) i njegovim testom, a zatim izvršiti kvantifikaciju fluorescencije da bismo dobili vrednost Ct.Ako vrijednost Ct zaostaje za vrijednošću Ct u reakciji bez uzorka, to ukazuje da je inhibitor prisutan u uzorku i inhibira efikasnost amplifikacije u reakciji.

05 Qubit metoda fluorescentne boje

Qubit Fluorometer je najčešće korišteni mali uređaj za detekciju koncentracije nukleinskih kiselina i čistoće, koji je jednostavan za rukovanje i postoji u gotovo svakom laboratoriju za molekularnu biologiju.Točno izračunava koncentraciju nukleinske kiseline otkrivanjem i fluorescentnom bojom koja vezuje nukleinsku kiselinu (Qubit detection reagens).Qubit ima visoku osjetljivost i specifičnost i može precizno kvantificirati RNK do koncentracije pg/µL.Pored dobro poznate sposobnosti preciznog kvantifikacije koncentracije nukleinske kiseline, Thermo Fisherov najnoviji novi model, Qubit 4.0, također može otkriti integritet RNK.Qubit 4.0 sistem za detekciju RNK (RNA IQ Assay) detektuje integritet RNK simultanim otkrivanjem dve specifične fluorescentne boje.Ove dvije fluorescentne boje mogu se vezati za velike fragmente i male fragmente RNK, respektivno.Ove dvije fluorescentne boje ukazuju na udio velikih fragmenata RNK u uzorku, a iz toga se može izračunati vrijednost IQ (Integritet i kvaliteta) koja predstavlja kvalitet RNK.Vrijednost IQ primjenjiva je i na FFPE i na ne-FFPE uzorke i ima veliki utjecaj na naknadni kvalitet sekvenciranja.Uzimajući NGS eksperimente kao primjer, u RNA-Seq test eksperimentima izvedenim na Ion torrent™ platformi, većina uzoraka sa IQ vrijednostima većim od 4 imala je najmanje 50% efektivnih očitavanja (Slika 5).U poređenju sa gore navedenim metodama detekcije, Qubit IQ Assay ne samo da je praktičniji za rad i traje manje vremena (unutar pet minuta), već ima i veliku korelaciju između izmerene vrednosti IQ parametra i kvaliteta podataka nizvodnih eksperimenata.

Na slici 5, postoji velika korelacija između Qubit RNA IQ vrijednosti i mapiranih očitavanja RNA-Seq.【5】

Kroz gornji uvod, vjerujem da svi imaju dovoljno razumijevanja o različitim metodama kontrole kvaliteta RNK.U praksi, možete biratiodgovarajuću metodu prema tipu uzorka i postojećim instrumentima.Samo dobrom kontrolom kvaliteta RNK možemo izbjeći neuspjeh narednih eksperimenata uzrokovan lošim kvalitetom uzorka, čime ćemo uštedjeti dragocjeno vrijeme, energiju i troškove.

Referentni proizvodi:

Komplet za izolaciju ukupne RNK životinja

Komplet za izolaciju ukupne RNA ćelije

reference

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: broj integriteta RNK za dodeljivanje vrednosti integriteta RNK merenjima.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Korisnički priručnik za repertoar Oncomine Human Immune (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, poboljšane metrike kvaliteta za procjenu RNA izvedene iz arhivskih uzoraka tkiva umetnutih u parafin fiksiranih u formalinu , stranica 12, Toksikološke nauke 12, Toksikološke nauke 12, kolovoz 12 57–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/