Sterilizacija vrhova pipeta i EP epruveta, itd.

1. Pripremite 0,1% (hiljaditi) DEPC (visoko toksična supstanca) sa dejonizovanom vodom, pažljivo ga koristite u haubi i čuvajte na 4°C dalje od svetlosti;

DEPC voda je čista voda tretirana DEPC-om i sterilisana visokom temperaturom i visokim pritiskom.Testirano da ne sadrži RNazu, DNazu i proteinazu.

2. Stavite vrh pipete i EP epruvetu u 0,1% DEPC i uverite se da su vrh pipete i EP epruveta napunjeni sa 0,1% DEP.

3. Zaštititi od svjetlosti, ostaviti da odstoji preko noći (12-24h)

4. Kutiju koja sadrži vrh i EP cijev ne treba namakati u DEPC.Nakon što grubo uklonite DEPC vodu iz vrha ili EP cijevi, zapakirajte je i zamotajte.

5. 121 stepen Celzijusa, 30 min

6. 180 stepeni Celzijusa, sušiti nekoliko sati (najmanje 3 sata)

Napomena: a.Nosite lateks rukavice i maske prilikom rukovanja DEPC-om!b, ili bez DEPC sterilizacije, 130 ℃, 90 min autoklava (mnoge laboratorije visokotemperaturna sterilizacija dvaput)

Razmatranja ekstrakcije RNK

Dva glavna fenomena neuspjeha izolacije tkivne RNK

degradacija RNK i ostaci nečistoća u tkivima,što se tiče degradacije, hajde da prvo pogledamo zašto se RNK ekstrahovana iz kultivisanih ćelija ne razgrađuje lako.Svi postojeći reagensi za ekstrakciju RNK sadrže komponente koje brzo inhibiraju RNKazu.Dodajte lizat kultivisanim ćelijama i jednostavno ga pomešajte, sve ćelije se mogu temeljno izmešati sa lizatom i ćelije su potpuno lizirane.Nakon što se ćelije liziraju, aktivni sastojci u lizatu odmah inhibiraju intracelularnu RNKazu, tako da RNK ostaje netaknuta.To znači da se kultivisane ćelije lako i potpuno dovode u kontakt sa lizatom, njihova RNK se ne razgrađuje lako;s druge strane, RNK u tkivu se lako razgrađuje jer ćelijama u tkivu nije lako brzo kontaktirati lizat.zbog dovoljnog kontakta.dakle,pod pretpostavkom da postoji način da se tkivo pretvori u jednu ćeliju dok se inhibira aktivnost RNK, problem degradacije bi mogao biti potpuno riješen.

Mljevenje tečnim azotom je najefikasnija takva metoda.Međutim, metoda mljevenja tekućim dušikom je vrlo problematična, posebno kada je broj uzoraka velik.To je dovelo do sljedeće najbolje stvari: homogenizatora.ThehomogenizatorMetoda ne razmatra pitanje kako se aktivnost RNase inhibira prije nego što ćelije stupe u kontakt sa lizatom, već se radije moli da je brzina poremećaja tkiva brža od brzine kojom intracelularna RNAza razgrađuje RN.

Efekat električnog homogenizatora je bolji,a efekat homogenizatora stakla je loš, ali općenito, metoda homogenizatora ne može spriječiti fenomen razgradnje.Stoga, ako je ekstrakcija degradirana, originalni električni homogenizator treba koristiti za mljevenje s tekućim dušikom;originalni stakleni homogenizator treba zamijeniti električnim homogenizatorom ili direktno samljeti tekućim dušikom.Problem je skoro 100% izvodljiv.riješi se.

Problem ostataka nečistoća koji utiče na naredne eksperimente ima više različitih uzroka od degradacije, a rješenja su shodno tome različita.U zakljucku,ako postoji degradacija ili zaostale nečistoće u tkivu, metoda ekstrakcije/reagens za određeni eksperimentalni materijal mora biti optimizirana.Ne morate koristiti svoje dragocjene uzorke za optimizaciju: možete kupiti male životinje poput ribe/pilića na pijaci, uzeti odgovarajući dio materijala za ekstrakciju RNK, a drugi dio za ekstrakciju proteina – samljeti ekstraktom iz usta, želuca i crijeva.

Ciljna RNK ekstrahirane RNK koristi se za različite naknadne eksperimente, a njeni zahtjevi za kvalitetom su različiti

Konstrukcija biblioteke cDNK zahtijeva integritet RNK bez ostataka inhibitora enzimske reakcije;Northern zahtijeva veći RNK integritet i niže zahtjeve za ostatke inhibitora enzimske reakcije;RT-PCR ne zahtijeva previsok RNK integritet,ali inhibira enzimske reakcije.Zahtjevi za ostatke su strogi.Ulaz određuje izlaz;svaki put kada je cilj dobiti RNK najveće čistoće, to će koštati ljude i novac.

Prikupljanje/čuvanje uzoraka

Faktori koji utječu na degradaciju Nakon što uzorak napusti živo tijelo/ili izvornu okolinu rasta, endogeni enzimi u uzorku će početi da razgrađuju RNK,a brzina razgradnje je povezana sa sadržajem endogenih enzima i temperaturom.Tradicionalno, postoje samo dva načina da se potpuno inhibira aktivnost endogenog enzima: odmah dodati lizat i temeljito i brzo homogenizirati;iseći na male komadiće i odmah zamrznuti u tečnom azotu.Oba pristupa zahtijevaju brz rad.Potonji je pogodan za sve uzorke, dok je prvi prikladan samo za tkiva sa niskim sadržajem ćelija i endogenih enzima i lakša za homogenizaciju.Konkretno, biljno tkivo, jetra, timus, gušterača, slezena, mozak, masnoće, mišićno tkivo, itd. najbolje je zamrznuti tečnim dušikom prije nego što nastavite.

Fragmentacija i homogenizacija uzoraka

Faktori koji utiču na degradaciju i prinos Fragmentacija uzorka jeza potpunu homogenizaciju, što je za potpuno i potpuno oslobađanje RNK.Ćelije se mogu direktno homogenizirati bez lomljenja.Tkiva se mogu homogenizirati tek nakon lomljenja.Kvasac i bakterije moraju se razbiti odgovarajućim enzimima prije nego što se mogu homogenizirati.Tkiva sa nižim sadržajem endogenih enzima i lakšom homogenizacijom mogu se usitniti i homogenizovati u jednom trenutku u lizatu pomoću homogenizatora;biljno tkivo, jetra, timus, gušterača, slezena, mozak, masnoće, mišićno tkivo i drugi uzorci, ili su bogati endogenim enzimima ili ih nije lako homogenizirati,pa se razbijanje tkiva i homogenizacija moraju obavljati odvojeno.Najpouzdanija i najproduktivnija metoda fragmentacije je mljevenje tekućim dušikom, a najpouzdanija metoda homogenizacije je korištenje električnog homogenizatora.Posebna napomena o mljevenju tečnim dušikom: uzorak se ne smije odmrznuti tokom cijelog procesa mljevenja, jer postoji veća vjerovatnoća da će endogeni enzimi funkcionisati kada su zamrznuti.

Izbor lizata

Utjecaj na praktičnost rada i faktore rezidualnih endogenih nečistoća Uobičajeni rastvori za lizu mogu skoro inhibirati aktivnost RNaze.Stoga je ključna točka odabira otopine za lizu razmotriti u kombinaciji s metodom pročišćavanja.Postoji jedan izuzetak:uzorcima s visokim sadržajem endogenih enzima preporučuje se korištenje lizata koji sadrži fenol kako bi se povećala sposobnost inaktivacije endogenih enzima.

Izbor metode prečišćavanja

Faktori koji utiču na rezidualne endogene nečistoće, brzinu ekstrakcije Za čiste uzorke kao što su ćelije, zadovoljavajući rezultati se mogu dobiti gotovo bilo kojom metodom prečišćavanja.Ali za mnoge druge uzorke, posebno one s visokim razinama nečistoća kao što su biljke, jetra, bakterije, itd., odabir odgovarajuće metode pročišćavanja je ključan.Metoda centrifugalnog prečišćavanja kolone ima veliku brzinu ekstrakcije i može efikasno ukloniti nečistoće koje utiču na kasniju enzimsku reakciju RNK, ali je skupa (Foregene može ponuditi isplative komplete, više detalja klikniteovdje);korišćenjem ekonomičnih i klasičnih metoda prečišćavanja, kao što je taloženje LiCl, takođe se mogu dobiti zadovoljavajući rezultati, ali je vreme rada dugo..

“Tri discipline i osam pažnje” za ekstrakciju RNK

Disciplina 1:Zaustavite kontaminaciju egzogenih enzima.

Napomena 1:Strogo nosite maske i rukavice.

Napomena 2:Centrifugalne epruvete, vrhove, šipke za pipete, rezervoare za elektroforezu i eksperimentalne klupe uključene u eksperiment treba temeljito zbrinuti.

Napomena 3:Reagensi/otopine uključene u eksperiment, posebno voda, moraju biti bez RNKaze.

Disciplina 2:Blokirajte aktivnost endogenih enzima

Napomena 4:Odaberite odgovarajuću metodu homogenizacije.

Napomena 5:Odaberite odgovarajući lizat.

Napomena 6:Kontrolišite početnu količinu uzorka.

Disciplina 3:Pojasnite svoju svrhu ekstrakcije

Napomena 7:Sa bilo kojim sistemom lizata koji se približava maksimalnoj početnoj količini uzorka, stopa uspjeha ekstrakcije naglo opada.

Napomena 8:Jedini ekonomski kriterij za uspješnu ekstrakciju RNK je uspjeh u narednim eksperimentima, a ne prinos.

Top 10 izvora kontaminacije RNase

1. Prsti su prvi izvor egzogenih enzima, tako da se rukavice moraju često nositi i mijenjati.Osim toga, moraju se nositi i maske, jer je disanje također važan izvor enzima.Dodatna prednost nošenja maske za rukavice je zaštita eksperimentatora.

2. Vrhovi za pipete, epruvete za centrifugiranje, pipete – RNaza se ne može inaktivirati samo sterilizacijom, tako da vrhove pipeta i epruvete za centrifugiranje treba tretirati DEPC, čak i ako su označeni kao DEPC tretirani.Najbolje je koristiti pipetu posebne namjene, prije upotrebe je obrisati vatom sa 75% alkohola, posebno štapićem;osim toga, pazite da ne koristite sredstvo za skidanje glave.

3. Voda/pufer mora biti bez kontaminacije RNase.

4. Barem testni sto treba obrisati vatom sa 75% alkohola.

5.Endogena RNAza Sva tkiva sadrže endogene enzime, tako da je brzo zamrzavanje tkiva tečnim azotom najbolji način da se smanji degradacija.Metoda skladištenja/mljevenja tečnog azota je zaista nezgodna, ali je to jedini način za tkiva sa visokim nivoom endogenih enzima.

6. Uzorci RNK Proizvodi ekstrakcije RNK mogu sadržavati tragove kontaminacije RNKazom.

7. Ekstrakcija plazmida Ekstrakcija plazmida često koristi Rnazu za razgradnju RNK, a preostala Rnaza treba da se digestira sa Proteinazom K i ekstrahuje pomoću PCI.

8. Skladištenje RNK Čak i ako se čuva na niskoj temperaturi, količine RNK u tragovima će uzrokovati degradaciju RNK.Najbolje rješenje za dugotrajno očuvanje RNK je sol/alkoholna suspenzija, jer alkohol inhibira sve enzimske aktivnosti na niskim temperaturama.

9. Kada kationi (Ca, Mg) sadrže ove ione, zagrijavanje na 80C u trajanju od 5 minuta će uzrokovati cijepanje RNK, tako da ako RNK treba da se zagreje, rastvor za konzerviranje treba da sadrži helirajuće sredstvo (1mM natrijum citrat, pH 6,4).

10. Enzimi korišteni u narednim eksperimentima mogu biti kontaminirani RNazom.

10 savjeta za ekstrakciju RNK

1: Brzo spriječite aktivnost RNase.Uzorci se brzo zamrzavaju nakon sakupljanja, a RNase se inaktivira brzim radom tokom lize.

2: Odaberite odgovarajuću metodu ekstrakcije za tkivo sa visokim sadržajem ribozima, a masno tkivo je najbolje koristiti metodu koja sadrži fenol.

3: Kvalitet predviđanja zahteva Northern, konstrukcija cDNK biblioteke zahteva visok integritet, a RT-PCR i RPA (test zaštite ribonukleaze) ne zahtevaju visok integritet.RT-PCR zahtijeva visoku čistoću (ostaci inhibitora enzima).

4: Temeljna homogenizacija je ključ za poboljšanje prinosa i smanjenje degradacije.

5: Provjerite integritet detekcije RNA elektroforeze, 28S: 18S = 2:1 je potpuni znak, 1:1 je također prihvatljiv za većinu eksperimenata.

6: Uklanjanje DNK za RT-PCR, niz analiza Najbolje je koristiti Dnazu I za uklanjanje DNK.

7: Smanjite kontaminaciju egzogenih enzima – enzimi se ne mogu uvoziti izvana.

8: Prilikom koncentriranja nukleinske kiseline niske koncentracije, treba dodati reagens za koprecipitaciju.Ali da bi se spriječila kontaminacija koprecipitanta koji sadrži enzime i DNK.

9: Temeljno otopiti RNK, ako je potrebno, zagrijati na 65C 5 minuta.

odgovarajući način skladištenja

Kratko se može čuvati na –20C, a dugo na –80C.Prvi korak u poboljšanju prinosa RNK je shvatanje da sadržaj RNK u različitim uzorcima uveliko varira.Visoka količina (2-4 ug/mg) kao što je jetra, gušterača, srce, srednja (0,05-2 ug/mg) kao što su mozak, embrion, bubrezi, pluća, timus, jajnik, niska (<0,05 ug/mg) mg) kao što su mokraćna bešika, kosti, masnoća.

1: Lizirati ćelije za oslobađanje RN – ako se RNK ne oslobodi, prinos će biti smanjen.Električna homogenizacija radi bolje od drugih metoda homogenizacije, ali će se možda morati kombinirati s drugim metodama, kao što je gnječenje tekućeg dušika, enzimska digestija (lizozim/litikaza)

2: Optimizacija metode ekstrakcije.Najveći problemi kod metoda zasnovanih na fenolu su nepotpuna stratifikacija i djelomični gubitak RNK (supernatant se ne može potpuno ukloniti).Nepotpuna stratifikacija je zbog visokog sadržaja nukleinske kiseline i proteina, što se može riješiti povećanjem količine korištenog lizata ili smanjenjem količine uzorka.Korak ekstrakcije hloroformom je dodat masnom tkivu.Gubitak RNK može se smanjiti povratnim pumpanjem ili uklanjanjem organskog sloja nakon čega slijedi centrifugiranje.Najveći problem sa metodama baziranim na centrifugiranju kolone je višak uzorka.

Klasični savjeti za ekstrakciju

1. Prečišćavanje fenola: Dodajte jednaku zapreminu 1:1 fenol/hloroform i snažno miješajte 1-2 minute.Centrifugirajte velikom brzinom 2 minute.Pažljivo uklonite supernatant (80-90%).Nikada nemojte doći do srednjeg sloja.Jednaka zapremina reakcionog rastvora se može dodati u fenol/hloroform i supernatant se ukloni.Dva supernatanta se mogu pomiješati zajedno za precipitaciju nukleinske kiseline kako bi se poboljšao prinos.Nemojte biti previše nježni prilikom miješanja i ne pokušavajte ukloniti sav supernatant.

2. Pranje sa 70-80% etanola: Tokom pranja, nukleinska kiselina mora biti suspendovana kako bi se osiguralo da se zaostala so ispere.Istovremeno, odmah nakon izlivanja etanola, centrifugirajte na velikoj brzini nekoliko sekundi, a zatim pipetom uklonite preostali etanol.Otopiti nakon stajanja na sobnoj temperaturi 5-10 minuta.

11. Ekstrakcija posebnih organizacija

1. Vlaknasto tkivo: Ključ za ekstrakciju RNK iz fibroznog tkiva kao što je srce/skeletni mišić je potpuno poremetiti tkivo.Ova tkiva imaju nisku ćelijsku gustinu, tako da je količina RNK po jedinici težine tkiva niska, te je najbolje koristiti što je moguće veću početnu količinu.Obavezno dobro samljeti maramicu pod uslovima smrzavanja.

2. Tkiva sa visokim sadržajem proteina/masti: sadržaj mozga/biljne masti je visok.Nakon ekstrakcije PCI, supernatant sadrži bijele flokule.Supernatant se mora ponovo ekstrahovati hloroformom.

3. Tkiva sa visokim sadržajem nukleinske kiseline/ribozima: slezina/timus ima visok sadržaj nukleinske kiseline i ribozima.Mljevenje tkiva pod uslovima zamrzavanja praćeno brzom homogenizacijom može efikasno inaktivirati ribozime.Međutim, ako je lizat previše viskozan (zbog visokog sadržaja nukleinske kiseline), ekstrakcija PCI neće moći efikasno stratificirati;dodavanje više lizata može riješiti ovaj problem.Višestruke ekstrakcije PCI mogu ukloniti više rezidualne DNK.Ako se bijeli talog formira odmah nakon dodavanja alkohola, to ukazuje na kontaminaciju DNK.Ponovna ekstrakcija kiselim PCI nakon rastvaranja može ukloniti kontaminaciju DNK.

4. Biljno tkivo: Biljno tkivo je složenije od životinjskog.Općenito, biljke se melju u uvjetima tekućeg dušika, tako da je razgradnja RNK endogenim enzimima neuobičajena.Ako se problem degradacije ne riješi, gotovo je sigurno uzrokovan nečistoćama sadržanim u uzorku.Nečistoće sadržane u mnogim biljkama dovest će do ostataka, a razlog za ostatke je često zato što ove nečistoće imaju neke sličnosti s RNK: vi precipitirate, a ja taložim, a vi adsorbirate, a ja adsorbiram.Ove karakteristike određuju da su vrlo jaki inhibitori enzima.

Trenutno se komercijalni reagensi za ekstrakciju RNK mogu prilagoditi gotovo svim životinjskim tkivima uz mala prilagođavanja, ali postoji nekoliko komercijalnih reagensa za ekstrakciju RNK koji mogu biti prikladni za većinu biljnih tkiva.Na sreću, Foregene može pružiti posebnesetovi za ekstrakciju RNK biljaka, imamoKomplet za izolaciju ukupne RNK biljaka, Komplet za izolaciju ukupne RNK biljaka Plus.Potonji je posebno dizajniran za biljke s visokim sadržajem polisaharida i polifenola.Za ekstrakciju RNK, povratne informacije od laboratorijskih korisnika su posebno dobre.

12. Učinak zamrzavanja i odmrzavanja uzoraka Zamrznuti uzorak može biti veći i potrebno ga je isjeći prije nego što se koristi za ekstrakciju RNK.Uzorci imaju tendenciju da se tope (moguće djelimično) tokom rezanja.Zamrznute uzorke će možda trebati izvagati prije ekstrakcije RNK, a odmrzavanje će se definitivno dogoditi tokom ovog procesa.Ponekad se odmrzavanje uzorka dešava i tokom procesa mlevenja tečnim azotom;ili se smrznuti uzorak direktno dodaje u lizat bez mljevenja tekućim dušikom, a odmrzavanje će se definitivno dogoditi prije potpune homogenizacije.Eksperimenti su pokazali da je smrznuto tkivo sklonije razgradnji RNK tokom odmrzavanja nego svježe tkivo.Vjerovatni razlog: proces zamrzavanja-odmrzavanja remeti strukture unutar ćelije, što olakšava endogenim enzimima da dođu u direktan kontakt sa RNK.

13. Procjena kvaliteta RNK Obično se elektroforeza koristi za procjenu integriteta RNK, a A260/A280 se koristi za procjenu čistoće RNK.U teoriji, intaktna RNK ima omjer 28S:18S = 2,7:1, a većina podataka naglašava omjer 28S:18S = 2:1.Činjenica je da gotovo nijedna RNK ekstrahirana iz uzoraka osim ćelija nije u omjeru 2:1 (ovo je dobiveno pomoću Agilent Bioanalyzera).

Na rezultate elektroforeze RNK utiču mnogi faktori, uključujući sekundarnu strukturu, uslove elektroforeze, opterećenje uzorka, stepen zasićenosti EB, itd. Koristite nativnu elektroforezu za detekciju RNK i koristite DNK marker kao kontrolu.Ako su 28S na 2 kb i 18S na 0,9 kb čisti, a 28S: 18S > 1, integritet može zadovoljiti zahtjeve većine narednih eksperimenata.

A260/A280 je indikator koji je izazvao dosta zabune.Prije svega, potrebno je razjasniti izvorno značenje ovog indikatora za nukleinske kiseline: čista RNK, njen A260/280 = oko 2,0.Čista RNK je 'uzrok', a A260/A280 = 2 je 'posledica'.Sada svi koriste A260/A280 kao 'uzrok', misleći da je "ako je A260/A280 = 2, onda je RNK čista", što prirodno dovodi do zabune.

Ako ste zainteresovani, možete dodati malo reagensa koji se često koristi u ekstrakciji, kao što je fenol, gvanidin izotiocijanat, PEG, itd., u vaš RNK uzorak, a zatim izmjerite omjer A260/A280.Realnost je da mnogi reagensi koji se koriste za ekstrakciju RNK, kao i mnoge nečistoće u uzorku, apsorbuju oko A260 i A280, utičući na A260/A280.

Najpoučniji pristup trenutno je skeniranje uzoraka RNK u rasponu od 200-300 nm.Kriva čiste RNK ima sledeće karakteristike: kriva je glatka, A230 i A260 su dve tačke preokreta, A300 je blizu 0, A260/A280 = oko 2,0 i A260/A230 = oko 2,0.Ako podaci skeniranja nisu dostupni, mora se odrediti i omjer A260/A230, jer je taj omjer osjetljiviji na prenošenje svih nečistoća koje utiču na enzimsku reakciju.Uzmite u obzir linearni raspon uređaja (0,1–0,5 za A260).

Postoje još dva korisna fenomena: omjer će biti oko 0,3 manji kada se A260/A280 mjeri u vodi;dok je omjer izmjeren u 10 mM EDTA oko 0,2 veći od onog izmjerenog u 1 mM EDTA.

Srodni proizvodi:

Proizvođač i dobavljač kompleta za izolaciju ukupne RNA u Kini |Foregene (foreivd.com)

Serija izolacije RNA Dobavljači i tvornice |Kineski proizvođači serije RNA izolacije (foreivd.com)

Serija izolacije RNA – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)