RT-qPCR eksperiment uključuje ekstrakciju RNK i procjenu kvaliteta, reverznu transkripciju i qPCR tri koraka, svaki korak ima puno mjera predostrožnosti, detaljno ćemo ih predstaviti u nastavku.

Ⅰ.Procjena kvaliteta RNK

U RT-qPCR eksperimentu, nakon završetka ekstrakcije RNK, potrebno je ocijeniti kvalitet RNK, a naknadni eksperiment se može izvesti tek nakon što je kvalifikovan.Metode evaluacije uključuju spektrofotometar, Agilent gel elektroforezu, Agilent 2100 analizu, među kojima se najčešće koriste spektrofotometar i detekcija elektroforezom u agaroznom gelu.Treba napomenuti da se ove dvije metode moraju koristiti zajedno kako bi se završila detekcija i analiza koncentracije RNK, čistoće i integriteta, kako bi se osigurao kvalitet RNK.

Povezani komplet za izolaciju RNA: 

Komplet za izolaciju ukupne RNA ćelije

Visoko pročišćena i visokokvalitetna ukupna RNK može se dobiti iz različitih kultiviranih ćelija za 11 minuta.

Komplet za izolaciju ukupne RNK životinja

Brzo i efikasno izdvajanje ukupne RNK visoke čistoće i visokog kvaliteta iz različitih životinjskih tkiva.

Spektrofotometar:

Spektrofotometar se uglavnom koristi za određivanje koncentracije i čistoće RNK, ali ne može otkriti integritet RNK i genomski ostatak.Među njima, A260/280 i A260/230 su važni parametri za detekciju čistoće RNK, a čistoća RNK se može detektovati prema fluktuaciji njihovih vrednosti:

1. 1.9< A260/280< 2.1, što ukazuje da je čistoća RNK dobra;A260/280<1,9, što ukazuje da može postojati proteinski ostatak u RNK;A260/280>2.1, što ukazuje na moguću delimičnu degradaciju RNK, što se dalje može potvrditi elektroforezom u agaroznom gelu.

2. 2.0< A260/230< 2.2, što ukazuje da je čistoća RNK dobra;A260/230< 2,0, što ukazuje na to da u RNK mogu postojati ostaci organskih reagensa, kao što su fenoli, etanol ili šećeri.

Elektroforeza u agaroznom gelu:

Analiza elektroforeze u agaroznom gelu može analizirati integritet RNK, genomske i proteinske ostatke, ali ne može precizno kvantificirati koncentraciju RNK ili otkriti ostatke organskih reagensa.Uzmimo eukariotske RNA šablone na primjer:

1. RNK je podvrgnuta elektroforezi u agaroznom gelu.Ako su na mapi gela bile samo tri pojedinačne trake 28sRNA, 18sRNA i 5.8sRNA, to ukazuje da je ekstrahirana RNK netaknuta.Ako postoji fenomen povlačenja, to ukazuje na djelomičnu degradaciju RNK.

2. Ako postoji jedna svijetla traka između rupe za ljepilo i trake 28sRNA, može postojati ostatak genomske DNK.

3. Ako se u otvoru za ljepilo pojavljuju trake, to ukazuje da možda postoje ostaci proteina i drugih makromolekularnih supstanci.

Ⅱ. Reverzna transkripcija

Nakon što je ekstrakcija RNK završena, treba je preokrenuti u cDNK za naredne eksperimente, tako da je korak preokreta neophodan.Reverzna transkripcija će se uvesti izborom reverzne transkriptaze i prajmera:

Odabir reverzne transkriptaze:

Tipične reverzne transkriptaze uključuju AMV RTase i MMLV RTase.RNase H AMV RTase ima jaku aktivnost, kratku dužinu sinteze, nisku količinu sinteze i dobru termičku stabilnost (42 ~ 55 ℃).Aktivnost RNase H MMLV RTase je slaba, dužina sinteze je duga, količina sinteze je velika, a termička stabilnost je loša (37 ~ 42 ℃).

Budući da enzim RNase H ima funkciju razgrađivanja RNA šablona, ​​MMLV sa slabom aktivnošću RNase H treba preferencijalno odabrati tokom reverzne transkripcije, a nakon kasnijeg genetskog inženjeringa, termička stabilnost MMLV je dostigla kvalitativni skok.Uzimanje ForegenaForeasy reverzna transkriptaza (M-MLV za obrnutu transkripciju) kao primjer, to je nova reverzna transkriptaza izražena u bakterijama koje su konstruirane E. coli korištenjem tehnologije genetske rekombinacije.To je rekombinantna DNK polimeraza koja sintetizira komplementarni lanac DNK iz jednolančane RNK, DNK ili hibrida RNA:DNK.Nema aktivnost RNaze H, ima jaku stabilnost, jak RNK afinitet i visoku osjetljivost na detekciju.

 

Foreasy reverzna transkriptaza (M-MLV za obrnutu transkripciju)

Izbor prajmera:

Generalno, RT prajmeri spadaju u tri kategorije: oligo dT, nasumični prajmeri i genski specifični prajmeri.Odaberite odgovarajuće prajmere za upotrebu prema različitim eksperimentalnim zahtjevima.

1. Ako je šablon eukariotskog porijekla i kasna cDNK se koristi za rutinsku PCR amplfikaciju, preporučuje se Oligo (dT);Ako se naknadni eksperiment koristi samo za qPCR, preporučuje se da se Oligo (dT) pomiješa sa nasumičnim prajmerima kako bi se poboljšala efikasnost reverzne transkripcije.

2. Ako je predložak od prokariota, za reverznu transkripciju treba odabrati nasumične prajmere ili prajmere specifične za gen.

Ⅲ.qPCR

Kvantifikacija fluorescencije se uglavnom razrađuje izborom kvantitativnih metoda, principima dizajna prajmera, odabirom ROX-a, konfiguracijom reakcionog sistema i postavljanjem uslova reakcije, itd.

Izbor kvantitativnih metoda:

Kvantitativne metode se dijele na relativne kvantitativne metode i apsolutne kvantitativne metode.Relativna kvantifikacija se može koristiti za otkrivanje efekta određenih metoda liječenja na ekspresiju gena, otkrivanje razlike u ekspresiji gena u različito vrijeme i upoređivanje razlike u ekspresiji gena u različitim tkivima.Apsolutna kvantifikacija može otkriti količinu nukleinske kiseline u virusu i tako dalje.Prilikom izvođenja eksperimenata moramo odabrati odgovarajuće kvantitativne metode prema vlastitim eksperimentima.

Principi dizajna prajmera:

Dizajn prajmera za qPCR direktno je povezan sa efikasnošću amplifikacije i specifičnošću proizvoda.Stoga je pravilno dizajniranje dobrih prajmera prvi korak uspješnog qPCR-a.U dizajnu prajmera treba obratiti pažnju na sledeće principe kada se ispunjava princip konvencionalnog dizajna prajmera:

1. Dužina ciljnog fragmenta je kontrolirana između 100 i 300 bp;

2. Dizajn unakrsnog egzona kako bi se izbjegao utjecaj genomske DNK;

3. Dizajnirane prajmere je potrebno testirati na efikasnost amplifikacije i tek kada efikasnost amplifikacije dostigne standard (90-110%) mogu se koristiti za kvantitativne eksperimente;

4. Koncentracija prajmera se obično optimizuje između 0,1uM i 1,0uM.

Izbor odROX:

U procesu kvantitativne reakcije, ROX može ravnomjerno podesiti razliku optičkog puta, grešku pipetiranja ili razliku volumena uzrokovanu isparavanjem i kondenzacijom, poboljšavajući ponovljivost rezultata.Međutim, treba napomenuti da je izbor ROX-a vezan za instrument.Ako qPCR instrument ima funkciju automatskog ispravljanja razlike između rupa, ne treba dodati ROX;u suprotnom, treba dodati ROX korekciju.Mali partneri u kupovini reagensa moraju biti u skladu sa instrumentom koji se koristi za odabir ispravnog ROX-a, izbjegavajte kasnije greške.

Priprema reakcionog sistema:

Poželjni su reakcioni volumeni od 20 ul i 50 ul.Prilikom formulisanja sistema treba obratiti pažnju na sledeća pitanja:

1. Reakcioni sistem treba pripremiti ventilacijom u ultra čistom radnom stolu, novi ddH₂O se koristi za svaki eksperiment;

2. Svaki eksperiment treba da pripremi NTC da bi se proverilo da li postoji zagađenje u sistemu, a svaki par prajmera treba da uradi NTC prilikom pripreme sistema;

3. Da bi se otkrilo da li postoji ostatak gDNK u RNK šablonu, NRT se može pripremiti za svaki uzorak za detekciju;

4. Prilikom pripreme sistema, preporučljivo je uraditi najmanje 3 tehnička ponavljanja za jedan uzorak;

5. Kada je šablon cDNK, preporučuje se razblaživanje 5-10 puta kako bi se smanjio inhibicijski efekat sistema reverzne transkripcije na qPCR eksperiment.Bolje je istražiti količinu šablona po gradijentu, tako da CT vrijednost padne između 20-30;

6. Odrediti potreban broj reakcija, povećati za 5-10% na osnovu broja reakcija i izračunati konfiguracijski broj zapremine;

7, sistem se priprema po principu premiksa, miješanjem nakon centrifugiranja i osigurava da nema mjehurića;

8, Što je više moguće odabrati pomoćni potrošni materijal.

Povezani RT-qPCR komplet