Fluorescentni kvantitativni PCR (također poznat kao TaqMan PCR, u daljem tekstu FQ-PCR) je nova kvantitativna tehnologija nukleinske kiseline koju je razvio PE (Perkin Elmer) u Sjedinjenim Državama 1995. Ova tehnologija se zasniva na konvencionalnom PCR-u dodavanjem fluorescentno označenih sondi.U poređenju sa fleksibilnim PCR-om, FQ-PCR ima mnogo prednosti u realizaciji svoje kvantitativne funkcije.Ovaj članak ima za cilj da ukratko opiše karakteristike, principe, metode i primjenu tehnologije.

1 Karakteristike

FQ-PCR ne samo da ima visoku osjetljivost običnog PCR-a, već i zbog primjene fluorescentnih sondi, može direktno otkriti promjenu fluorescentnog signala tokom PCR amplifikacije kroz sistem fotoelektrične provodljivosti kako bi se dobili kvantitativni rezultati, čime se prevazilaze mnogi nedostaci konvencionalnog PCR-a, tako da ima i visoku specifičnost DNK-a i visokoskopske tehnologije.

Na primjer, opće PCR proizvode je potrebno promatrati elektroforezom u agaroznom gelu i bojenjem etidij bromidom ultraljubičastom svjetlošću ili poliakrilamidnom gel elektroforezom i bojenjem srebrom.Ovo ne zahtijeva samo više instrumenata, već zahtijeva i vrijeme i trud.Korištene mrlje Etidijev bromid štetne su za ljudski organizam, a ovi komplikovani eksperimentalni postupci pružaju mogućnosti za zagađenje i lažne pozitivne rezultate.Međutim, FQ-PCR treba samo jednom otvoriti poklopac tokom punjenja uzorka, a naknadni proces je potpuno zatvorena epruveta, koja ne zahtijeva naknadnu obradu PCR-a, izbjegavajući mnoge nedostatke u konvencionalnim PCR operacijama.Eksperiment generalno koristi termalni ciklus ABI7100 PCR koji je razvila PE kompanija.

Instrument ima sljedeće karakteristike: ① Široka primjena: Može se koristiti za kvantifikaciju DNK i RNA PCR proizvoda, istraživanje genske ekspresije, detekciju patogena i optimizaciju PCR uslova.② Jedinstveni kvantitativni princip: Korišćenjem fluorescentno obeleženih sondi, količina fluorescencije će se akumulirati sa PCR ciklusom nakon laserske ekscitacije, kako bi se postigla svrha kvantifikacije.③ Visoka radna efikasnost: Ugrađeni 9600 PCR termalni ciklus, kompjuterski kontrolisan 1 do 2 sata da se završi amplifikacija i kvantifikacija 96 uzoraka automatski i sinhrono.④ Nema potrebe za gel elektroforezom: Nema potrebe za razrjeđivanjem i elektroforezom uzorka, samo koristite posebnu sondu za detekciju direktno u reakcijskoj cijevi.⑤Bez zagađenja u cjevovodu: Usvojena je jedinstvena potpuno zatvorena reakciona cijev i fotoelektrični provodni sistem, tako da nema potrebe da brinete o zagađenju.⑥Rezultati su ponovljivi: kvantitativni dinamički opseg je do pet redova veličine.Stoga, budući da je ova tehnologija uspješno razvijena, cijenjena je od strane mnogih naučnih istraživača i primjenjivana u mnogim oblastima.

2 Principi i metode

Princip rada FQ-PCR-a je korištenje 5′→3′ egzonukleazne aktivnosti Taq enzima za dodavanje fluorescentno označene sonde u PCR reakcijski sistem.Sonda se može specifično hibridizirati sa DNK šablonom koji se nalazi u sekvenci prajmera.5′kraj sonde je označen genom za emisiju fluorescencije FAM (6-karboksifluorescein, pik emisije fluorescencije na 518nm), a 3′kraj je označen sa The fluorescence quenching group TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine 6-carboxytetramethylrhodamine), Inning sonde je fosforiliran kako bi se spriječilo proširenje sonde tokom PCR amplifikacije.Kada sonda ostane netaknuta, grupa za gašenje potiskuje emisiju fluorescencije grupe koja emituje.Jednom kada se emitivna grupa odvoji od grupe za gašenje, inhibicija se poništava, a optička gustina na 518 nm se povećava i detektuje je sistemom za detekciju fluorescencije. U fazi renaturacije, sonda se hibridizuje sa DNK šablona, ​​a Taq enzim u fazi ekstenzije prajmera se kreće duž DNK prajmera.Kada je sonda prekinuta, efekat gašenja se oslobađa i fluorescentni signal se oslobađa.Svaki put kada se šablon kopira, sonda se odsiječe, praćeno oslobađanjem fluorescentnog signala.Budući da postoji odnos jedan-na-jedan između broja oslobođenih fluorofora i broja PCR proizvoda, ova tehnika se može koristiti za preciznu kvantifikaciju šablona.Eksperimentalni instrument uglavnom koristi termalni ciklus ABI7100 PCR koji je razvila PE kompanija, a mogu se koristiti i drugi termalni ciklusi.Ako se za eksperiment koristi reakcijski sistem tipa ABI7700, nakon završetka reakcije, kvantitativni rezultati se mogu direktno dati kompjuterskom analizom.Ako koristite druge termociklere, trebate koristiti detektor fluorescencije za mjerenje signala fluorescencije u reakcionoj cijevi u isto vrijeme kako biste izračunali RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ predstavlja omjer intenziteta luminescencije fluorescentne emisione grupe epruvete uzorka i intenziteta luminiscencije grupe za gašenje, RQ- predstavlja omjer dva u praznoj epruveti, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) predstavlja količinu fluorescentnog signala koji se može dobiti nakon obrade fluorescentnih podataka.Uvođenjem fluorescentnih sondi značajno je poboljšana specifičnost eksperimenta.Dizajn sonde generalno treba da ispunjava sledeće uslove: ①Dužina sonde treba da bude oko 20-40 baza kako bi se osigurala specifičnost vezivanja.②Sadržaj GC baza je između 40% i 60% kako bi se izbjeglo dupliciranje pojedinačnih nukleotidnih sekvenci.③ Izbjegavajte hibridizaciju ili preklapanje sa prajmerima.④ Stabilnost vezivanja između sonde i šablona je veća od stabilnosti vezivanja između prajmera i šablona, ​​tako da vrednost Tm sonde treba da bude najmanje 5°C viša od Tm vrednosti prajmera.Osim toga, koncentracija sonde, homologija između sonde i šablonske sekvence i udaljenost između sonde i prajmera imaju uticaj na eksperimentalne rezultate.

Srodni proizvodi:

Kina Lnc-RT Heroᵀᴹ I(sa gDNazom)(super premiks za sintezu prvog lanca cDNK iz lncRNA) Proizvođač i dobavljač |Foregene (foreivd.com)

Kineski PCR u realnom vremenu Easyᵀᴹ-Taqman proizvođač i dobavljač |Foregene (foreivd.com)