Osnova dizajna prajmera (99% problema se može riješiti)
1. Dužina prajmera: Za udžbenik je potrebno 15-30bp, obično oko 20bp.Stvarno stanje je bolje da bude 18-24bp da bi se osigurala specifičnost, ali što je duže to bolje, predugačak prajmer će također smanjiti specifičnost i smanjiti prinos.
2. Raspon amplifikacije prajmera: 200-500bp je prikladno, a fragment se može proširiti na 10kb pod određenim uslovima.
3. Podloga za prajmer: Sadržaj G+C treba da bude 40-60%, premali efekat G+C pojačanja nije dobar, previše G+C može lako da se pojave nespecifične trake.ATGC se najbolje raspoređuje nasumično, izbjegavajući klastere od više od 5 purinskih ili pirimidinskih nukleotida.Multi-gc za 5′ kraj i međusekvence za povećanje stabilnosti, izbegavanje bogatog GC na kraju 3′, bez GC za poslednje 3 baze ili bez GC za 3 od poslednjih 5 baza.
4. Izbjegavajte sekundarnu strukturu u prajmerima i izbjegavajte komplementaciju između dva prajmera, posebno komplementaciju na 3' kraju, inače će se formirati dimer prajmera i stvoriti nespecifične pojačane trake.
5. Baze na 3' kraju prajmera, posebno posljednja i pretposljednja baza, trebaju biti striktno uparene kako bi se izbjegao neuspjeh PCR-a zbog neuparenih terminalnih baza.
6. Prajmeri imaju ili se mogu dodati sa odgovarajućim mjestima cijepanja, a amplificirana ciljna sekvenca bi poželjno trebala imati odgovarajuća mjesta cijepanja, što je vrlo korisno za analizu cijepanja ili molekularno kloniranje.
7. Specifičnost prajmera: prajmeri ne bi trebalo da imaju očiglednu homologiju sa drugim sekvencama u bazi podataka sekvenci nukleinskih kiselina.
8. Naučite koristiti softver: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (ovaj online dizajn najbolje funkcionira).
Gornji sadržaj može riješiti najmanje 99% problema dizajna prajmera.
Kontrolišite detalje dizajna prajmera
1. Dužina prajmera
Opšta dužina prajmera je 18~30 baza.Općenito, najvažniji faktor koji određuje temperaturu žarenja prajmera je dužina prajmera.Obično se bira temperatura žarenja prajmera (Tm vrijednost -5℃), a neki direktno koriste Tm vrijednost.Sljedeće formule mogu se koristiti za grubo izračunavanje temperature žarenja prajmera.
Kada je dužina prajmera manja od 20 bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Kada je dužina prajmera veća od 20 bp: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/dužina-5℃
Osim toga, mnogi softveri se također mogu koristiti za izračunavanje temperature žarenja, princip proračuna će biti drugačiji, tako da ponekad izračunata vrijednost može imati mali jaz.Za optimizaciju PCR reakcija koriste se najkraći prajmeri koji osiguravaju temperature žarenja ne manje od 54℃ za najbolju efikasnost i specifičnost.
Sve u svemu, specifičnost prajmera se povećava za faktor četiri za svaki dodatni nukleotid, tako da je minimalna dužina prajmera za većinu aplikacija 18 nukleotida.Gornja granica dužine prajmera nije od velike važnosti, uglavnom se odnosi na efikasnost reakcije.Zbog entropije, što je prajmer duži, to je niža brzina kojom se on žari da bi se vezao za ciljnu DNK kako bi se formirao stabilan dvolančani šablon za DNK polimerazu da se veže.
Kada se koristi softver za dizajniranje prajmera, dužina prajmera se može odrediti pomoću TM vrijednosti, posebno za prajmere fluorescentnog kvantitativnog PCR-a, TM=60℃ ili tako nešto treba kontrolisati.
2.GC sadržaj
Generalno, sadržaj G+C u sekvencama prajmera je 40%~60%, a sadržaj GC i Tm vrednost para prajmera treba da budu koordinisani.Ako prajmer ima ozbiljnu GC ili AT tendenciju, odgovarajuća količina A, T ili G i C repa može se dodati na 5' kraj prajmera.
3. Temperatura žarenja
Temperatura žarenja bi trebala biti 5 ℃ niža od temperature oslobađanja lanca.Ako je broj baza prajmera mali, temperatura žarenja se može povećati na odgovarajući način, što može povećati specifičnost PCR-a.Ako je broj baza velik, temperatura žarenja se može na odgovarajući način smanjiti.Razlika u temperaturi žarenja između para prajmera od 4℃ ~ 6℃ neće uticati na prinos PCR-a, ali idealno je da temperatura žarenja para prajmera bude ista, koja može da varira između 55℃ ~ 75℃.
4. Izbjegavajte područje sekundarne strukture šablona za pojačavanje
Najbolje je izbjeći područje sekundarne strukture šablona prilikom odabira pojačanog fragmenta.Stabilna sekundarna struktura ciljnog fragmenta može se predvidjeti i procijeniti relevantnim kompjuterskim softverom, koji je od pomoći za odabir šablona.Eksperimentalni rezultati pokazuju da je širenje često neuspješno kada je slobodna energija (△G) područja koje treba proširiti manja od 58,6 lkJ/mol.
5. Neusklađenost sa ciljnom DNK
Kada je amplificirana ciljna DNK sekvenca velika, prajmer se može vezati za više dijelova ciljne DNK, što rezultira pojavom više traka u rezultatu.Ovaj put je potrebno koristiti testiranje softvera BLAST, web stranicu:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Odaberite Poravnaj dvije sekvence (bl2seq).
Lepljenje sekvenci prajmera u zonu 1 i sekvenci ciljne DNK u zonu 2 je zamenljivo, a BLAST izračunava komplementarne, antisense i druge mogućnosti, tako da korisnici ne moraju da primećuju da li su oba lanca čulni lanci.Također možete unijeti GI broj ako znate GI broj sekvence u bazi podataka, tako da ne morate lijepiti veliki dio niza.Na kraju, kliknite na Poravnaj na 3 da vidite da li prajmer ima više homolognih mjesta u ciljnoj DNK.
6. Terminal za prajmer
3' kraj prajmera je mjesto gdje počinje proširenje, tako da je važno spriječiti da neusklađenosti počnu tamo.Kraj 3' ne bi trebao biti više od 3 uzastopna G ili C, jer će to uzrokovati da se prajmer greškom aktivira u regiji sekvence obogaćivanja G+C.Kraj 3' ne može formirati nikakvu sekundarnu strukturu, osim u specijalnim PCR (AS-PCR) reakcijama, 3' kraj prajmera ne može biti neusklađen.Na primjer, ako je kodirajuća regija pojačana, 3' kraj prajmera ne bi trebao biti prekinut na trećoj poziciji kodona, jer je treća pozicija kodona sklona degeneraciji, što će uticati na specifičnost i efikasnost amplifikacije.Kada koristite aneksijske prajmere, pogledajte tabelu upotrebe kodona, obratite pažnju na biološke preferencije, nemojte koristiti aneksijske prajmere na 3′ kraju i koristite veću koncentraciju prajmera (1uM-3uM).
7. Sekundarna struktura prajmera
Sami prajmeri ne bi trebali imati komplementarne sekvence, inače će se sami prajmeri saviti u strukture ukosnica, a ova sekundarna struktura će utjecati na vezivanje prajmera i šablona zbog sterične smetnje.Ako se koristi umjetna prosudba, kontinuirane komplementarne baze samih prajmera ne bi trebale biti veće od 3bp.Ne bi trebalo biti komplementarnosti između dva prajmera, posebno treba izbegavati komplementarno preklapanje 3' kraja kako bi se sprečilo stvaranje dimera prajmera.Općenito, ne bi trebalo postojati više od 4 uzastopne baze homologije ili komplementarnosti između para prajmera.
8. Dodajte markere ili lokuse
5' kraj ima mali uticaj na specifičnost amplifikacije i stoga se može modifikovati bez uticaja na specifičnost amplifikacije.Modifikacija 5' kraja prajmera uključivala je: dodavanje restriktivnog mesta enzima;Označeni biotin, fluorescencija, digoksin, Eu3+, itd. Uvesti sekvence DNK koje se vezuju za proteine;Uvođenje mutacijskih mjesta, umetanje i izostanak mutacijskih sekvenci i uvođenje promotorskih sekvenci, itd. Dodatne baze će manje-više uticati na efikasnost amplifikacije i povećati šanse za formiranje dimera prajmera, ali se moraju napraviti neki ustupci za sljedeći korak.Dodatne sekvence koje ne postoje na ciljnoj sekvenci, kao što su restrikcijska mjesta i promotorske sekvence, mogu se dodati na 5′ kraj prajmera bez utjecaja na specifičnost.Ove sekvence nisu uključene u izračunavanje vrijednosti prajmera Tm, ali ih treba testirati na komplementarnost i unutrašnju sekundarnu strukturu.
9. Subklonovi
Većinu vremena, PCR je samo preliminarno kloniranje, a zatim moramo subklonirati ciljni fragment u različite vektore, tako da moramo dizajnirati dodatne baze za sljedeću operaciju u PCR koraku.
Neke sekvence dizajnirane za subkloniranje su sažete u nastavku.
Dodano je restrikcijsko mjesto endonukleaze
Dodavanje restrikcijskih mjesta enzima je najčešće korištena metoda za subkloniranje PCR proizvoda.Općenito, mjesto cijepanja je šest baza, pored 5 'kraja mjesta cijepanja potrebno je dodati 2 ~ 3 zaštitne baze.Međutim, broj zaštitnih baza koje zahtijevaju različiti enzimi je različit.Na primjer, SalⅠ ne zahtijeva zaštitnu bazu, EcoRⅤ zahtijeva 1 zaštitnu bazu, NotⅠ zahtijeva 2 zaštitne baze, a Hind Ⅲ zahtijeva 3 zaštitne baze.
LIC dodaje rep
Puni naziv LIC-a je kloniranje neovisno o ligaciji, metoda kloniranja koju je izumio Navogen posebno za svoj dio pET vektora.PET nosač pripremljen LIC metodom ima nekomplementarne 12-15 baznih jednolančanih ljepljivih krajeva, koji dopunjuju odgovarajuće ljepljive krajeve na ciljnom fragmentu umetka.Za potrebe amplifikacije, sekvenca prajmera 5′ umetnutog fragmenta treba da dopuni LIC vektor.Ekstranektna aktivnost 3′→5′ T4 DNK polimeraze može da formira jedan lanac lepljivog kraja na umetnutom fragmentu nakon kratkog vremena.Budući da se proizvod može formirati samo međusobnim žarenjem pripremljenog fragmenta inserta i vektora, ova metoda je vrlo brza i efikasna, a radi se o usmjerenom kloniranju.
Usmjereni TA klon dodati rep
TA kloniranje nije moglo ciljati fragment u vektor, pa je kasnije Invitrogen uveo vektor koji je mogao ciljati kloniranje, koji je sadržavao četiri istaknute baze GTGGS na jednom kraju.Stoga, u dizajnu PCR prajmera, treba dodati komplementarne sekvence u skladu sa tim, tako da se fragmenti mogu „orijentisati“.
Ako nemate dovoljno vremena, možete isprobati direktnu sintezu, kombinujući gen sa vektorom, što mi kod muskularista nazivamo sintezom ET gena.
D. Metoda kloniranja u fuziji
Nije potrebna ligaza, nije potrebna duga reakcija.Sve dok se sekvenca na oba kraja lineariziranog vektora uvodi u dizajn prajmera, zatim se PCR proizvod i linearizirani vektor dodaju u infuzionu otopinu enzima koja sadrži BSA i stave na sobnu temperaturu pola sata, transformacija se može izvršiti.Ova metoda je posebno pogodna za konverziju velikog volumena.
10. Spajanje prajmera
Ponekad su o dizajnu prajmera poznate samo ograničene informacije o sekvenci.Na primjer, ako je poznata samo sekvenca aminokiselina, može se dizajnirati prajmer za spajanje.Prajmer spajanja je mješavina različitih sekvenci koje predstavljaju sve različite mogućnosti baza koje kodiraju jednu aminokiselinu.Da biste povećali specifičnost, možete se obratiti tablici upotrebe kodona kako biste smanjili aneksiju prema preferencijama osnovne upotrebe različitih organizama.Hipoksantin se može upariti sa svim bazama kako bi se smanjila temperatura žarenja prajmera.Nemojte koristiti priložene baze na 3′ kraju prajmera jer je žarenje poslednje 3 baze na 3′ kraju dovoljno da započne PCR na pogrešnom mestu.Koriste se veće koncentracije prajmera (1 μM do 3 μM) jer prajmeri u mnogim smešama za aneksiju nisu specifični za ciljni šablon.
PCR sirovinekontrolu
1. Količina prajmera
Koncentracija svakog prajmera je 0,1 ~ 1 umol ili 10 ~ 100 pmol.Bolje je postići željeni rezultat s najmanjom količinom prajmera.Visoka koncentracija prajmera će uzrokovati neusklađenost i nespecifično amplifikaciju i povećati šansu za formiranje dimera između prajmera.
2. Koncentracija prajmera
Koncentracija prajmera utiče na specifičnost.Optimalna koncentracija prajmera je uglavnom između 0,1 i 0,5 μM.Veće koncentracije prajmera dovode do amplifikacije nespecifičnih proizvoda.
3. Temperatura žarenja prajmera
Drugi važan parametar za prajmere je temperatura topljenja (Tm).Ovo je temperatura kada je 50% prajmera i komplementarnih sekvenci predstavljeno kao dvolančani DNK molekuli.Tm je potreban za postavljanje temperature žarenja PCR-a.U idealnom slučaju, temperatura žarenja je dovoljno niska da osigura efikasno žarenje prajmera sa ciljnom sekvencom, ali dovoljno visoka da smanji nespecifično vezivanje.Razumna temperatura žarenja od 55℃ do 70℃.Temperatura žarenja je općenito postavljena 5℃ niža od Tm prajmera.
Postoji nekoliko formula za postavljanje Tm, koje se jako razlikuju ovisno o korištenoj formuli i redoslijedu prajmera.Budući da većina formula daje procijenjenu vrijednost Tm, sve temperature žarenja su samo početna točka.Specifičnost se može poboljšati analizom nekoliko reakcija koje progresivno podižu temperaturu žarenja.Počnite ispod procijenjenog Tm-5℃, i postepeno povećavajte temperaturu žarenja u porastu od 2℃.Viša temperatura žarenja će smanjiti stvaranje dimera prajmera i nespecifičnih proizvoda.Za najbolje rezultate, dva prajmera treba da imaju približne vrednosti Tm.Ako je razlika Tm parova prajmera veća od 5℃, prajmeri će pokazati značajan pogrešan start upotrebom niže temperature žarenja u ciklusu.Ako su dva prajmera Tm različita, podesite temperaturu žarenja na 5℃ nižu od najnižeg Tm.Alternativno, da bi se povećala specifičnost, pet ciklusa se može izvesti prvo na temperaturama žarenja dizajniranim za više Tm, nakon čega slijede preostali ciklusi na temperaturama žarenja dizajniranim za niže Tm.Ovo omogućava dobivanje djelomične kopije odredišnog predloška u teškim uvjetima.
4. Čistoća i stabilnost prajmera
Standardna čistoća prilagođenih prajmera je adekvatna za većinu PCR aplikacija.Uklanjanje benzoil i izobutilil grupa odsoljavanjem je minimalno i stoga ne ometa PCR.Neke aplikacije zahtijevaju pročišćavanje kako bi se uklonile sve sekvence koje nisu pune dužine u procesu sinteze.Ove skraćene sekvence nastaju jer efikasnost kemijske sinteze DNK nije 100%.Ovo je kružni proces koji koristi ponovljene hemijske reakcije dok se svaka baza dodaje da se napravi DNK od 3′ do 5′.Možete propasti ni u jednom ciklusu.Duži prajmeri, posebno oni veći od 50 baza, imaju veliki udio skraćenih sekvenci i mogu zahtijevati pročišćavanje.
Na prinos prajmera utiče efikasnost sintetičke hemije i metode prečišćavanja.Biofarmaceutske kompanije, kao što su Cytology i Shengong, sve koriste minimalnu OD jedinicu kako bi osigurale ukupni izlaz oligonukleozida.Prilagođeni prajmeri se isporučuju u obliku suvog praha.Najbolje je ponovo otopiti prajmere u TE tako da konačna koncentracija bude 100 μM.TE je bolji od deionizirane vode jer je pH vode često kiseli i uzrokuje hidrolizu oligonukleozida.
Stabilnost prajmera zavisi od uslova skladištenja.Suvi prah i rastvoreni prajmeri treba da se čuvaju na -20℃.Prajmeri rastvoreni u TE u koncentracijama većim od 10 μM mogu se stabilno čuvati na -20℃ tokom 6 meseci, ali se mogu čuvati samo na sobnoj temperaturi (15℃ do 30℃) manje od 1 nedelje.Prajmeri u suvom prahu mogu se čuvati na -20 C najmanje 1 godinu i na sobnoj temperaturi (15 C do 30 C) do 2 meseca.
5. Enzimi i njihove koncentracije
Trenutno, Taq DNK polimeraza je u osnovi enzim genskog inženjeringa koji sintetiziraju koliformne bakterije.Količina enzima potrebna za katalizu tipične PCR reakcije je oko 2,5U (odnosi se na ukupnu zapreminu reakcije od 100ul).Ako je koncentracija previsoka, to može dovesti do nespecifičnog pojačanja;ako je koncentracija preniska, količina sintetičkog proizvoda će se smanjiti.
6. Kvalitet i koncentracija dNTP
Kvalitet dNTP je usko povezan sa koncentracijom i efikasnošću PCR amplifikacije.DNTP prah je granuliran, a njegova varijabilnost gubi svoju biološku aktivnost ako se nepravilno skladišti.Otopina dNTP je kisela i treba se koristiti u visokoj koncentraciji, sa 1M NaOH ili 1M Tris.HCL puferskom otopinom da se podesi PH na 7,0 ~ 7,5, mala količina pod-pakovanja, zamrznuto skladištenje na -20℃.Višestruko zamrzavanje-odmrzavanje će degradirati dNTP.U PCR reakciji, dNTP bi trebao biti 50 ~ 200 umol/L.Posebno treba obratiti pažnju na to da koncentracija četiri DNTPS-a bude jednaka (jednaka priprema mola).Ako se koncentracija bilo kojeg od njih razlikuje od ostalih (viša ili niža), doći će do neusklađenosti.Preniska koncentracija će smanjiti prinos PCR proizvoda.dNTP se može kombinovati sa Mg2+ i smanjiti koncentraciju slobodnog Mg2+.
7. Predložak (ciljni gen) nukleinska kiselina
Količina i stepen pročišćavanja šablonske nukleinske kiseline jedna je od ključnih karika za uspjeh ili neuspjeh PCR-a.Tradicionalne metode pročišćavanja DNK obično koriste SDS i proteazu K za varenje i odlaganje uzoraka.Glavne funkcije SDS-a su: otapanje lipida i proteina na ćelijskoj membrani, uništavajući na taj način ćelijsku membranu otapanjem membranskih proteina, i disocirati nuklearne proteine u ćeliji, SDS se takođe može kombinovati sa proteinima i taložiti;Proteaza K može hidrolizirati i probaviti proteine, posebno histone vezane za DNK, a zatim koristiti organski rastvarač fenol i hloroform za ekstrakciju proteina i drugih ćelijskih komponenti, te koristiti etanol ili izopropil alkohol za precipitaciju nukleinske kiseline.Ekstrahirana nukleinska kiselina može se koristiti kao šablon za PCR reakcije.Za uzorke za opštu kliničku detekciju, brza i jednostavna metoda može se koristiti za otapanje ćelija, lizat patogena, probavu i uklanjanje proteina iz hromozoma do slobodnih ciljnih gena i direktno koristiti za PCR amplifikaciju.Ekstrakcija RNA šablona obično koristi metodu gvanidin izotiocijanata ili proteaze K kako bi se spriječila RNAza da razgradi RNK.
8.Mg2+ koncentracija
Mg2+ ima značajan uticaj na specifičnost i prinos PCR amplifikacije.U općoj PCR reakciji, kada je koncentracija različitih dNTP 200 umol/L, odgovarajuća koncentracija Mg2+ je 1,5 ~ 2,0 mmol/L.Koncentracija Mg2+ je previsoka, specifičnost reakcije se smanjuje, dolazi do nespecifične amplifikacije, preniska koncentracija će smanjiti aktivnost Taq DNK polimeraze, što rezultira smanjenjem produkata reakcije.
Joni magnezija utiču na nekoliko aspekata PCR-a, kao što je aktivnost DNK polimeraze, što utiče na prinos;Drugi primjer je žarenje prajmera, što utiče na specifičnost.dNTP i šablon se vezuju za magnezijev jon, smanjujući količinu slobodnog jona magnezijuma potrebnog za aktivnost enzima.Optimalna koncentracija jona magnezijuma varira za različite parove prajmera i šablone, ali tipična početna koncentracija za PCR sa 200 μM dNTP je 1,5 mM (napomena: za kvantitativni PCR u realnom vremenu, koristite rastvor magnezijumovih jona od 3 do 5 mM sa fluorescentnom sondom).Veće koncentracije slobodnih jona magnezijuma povećavaju prinos, ali i povećavaju nespecifično pojačanje i smanjuju vjernost.Da bi se odredila optimalna koncentracija, titracije jona magnezijuma su vršene u koracima od 0,5 mM od 1 mM do 3 mM.Da bi se smanjila zavisnost od optimizacije jona magnezijuma, može se koristiti Platinum Taq DNK polimeraza.Platinum Taq DNK polimeraza je u stanju da održi funkciju u širem rasponu koncentracija magnezijumovih jona od Taq DNK polimeraze i stoga zahteva manje optimizacije.
9. Aditivi koji promovišu Pcr
Optimizacija temperature žarenja, dizajna prajmera i koncentracije magnezijevih jona dovoljna je za visoko specifično pojačanje većine šablona;međutim, neki predlošci, uključujući one sa visokim sadržajem GC-a, zahtijevaju dodatne mjere.Aditivi koji utiču na temperaturu topljenja DNK pružaju još jedan način za poboljšanje specifičnosti proizvoda i prinosa.Za najbolje rezultate potrebna je potpuna denaturacija šablona.
Osim toga, sekundarna struktura sprječava vezivanje prajmera i proširenje enzima.
PCR aditivi, uključujući formamid, DMSO, glicerin, betain i PCRx Enhancer Solution, poboljšavaju amplifikaciju.Njihov mogući mehanizam je smanjenje temperature topljenja, čime se pomaže žarenje prajmera i pomaže proširenje DNK polimeraze kroz regiju sekundarne strukture.PCRx rješenje ima i druge prednosti.Potrebna je minimalna optimizacija jona magnezijuma kada se koristi sa Platinum Taq DNK polimerazom i Platinum Pfx DNK polimerazom.Dakle, Platinum tehnika je kombinovana sa dodatkom kako bi se povećala specifičnost uz istovremeno smanjenje zavisnosti trećeg pristupa, optimizacije jona magnezijuma.Za najbolje rezultate treba optimizirati koncentraciju aditiva, posebno DMSO, formamida i glicerola, koji inhibiraju Taq DNK polimerazu.
10. Hot start
Hot start PCR je jedna od najvažnijih metoda za poboljšanje specifičnosti PCR-a pored dobrog dizajna prajmera.Iako je optimalna temperatura elongacije Taq DNK polimeraze 72℃, polimeraza ostaje aktivna na sobnoj temperaturi.Dakle, nespecifični proizvodi se proizvode kada je temperatura držanja niža od temperature žarenja tokom pripreme PCR reakcije i na početku termičkog ciklusa.Jednom formirani, ovi nespecifični proizvodi se efikasno pojačavaju.Hot-start PCR je posebno efikasan kada su mjesta koja se koriste za dizajn prajmera ograničena lokacijom genetskih elemenata, kao što su mutacije usmjerene na mjesto, kloniranje ekspresije ili konstrukcija i manipulacija genetskim elementima koji se koriste za DNK inženjering.
Uobičajena metoda za ograničavanje aktivnosti Taq DNK polimeraze je pripremanje otopine za PCR reakciju na ledu i postavljanje u prethodno zagrijani PCR aparat.Ova metoda je jednostavna i jeftina, ali ne dovršava aktivnost enzima i stoga ne eliminira u potpunosti amplifikaciju nespecifičnih proizvoda.
Termički prajming odlaže sintezu DNK inhibiranjem bitne komponente sve dok PCR aparat ne dostigne temperaturu denaturacije.Većina metoda ručnog termičkog iniciranja, uključujući odloženo dodavanje Taq DNK polimeraze, je glomazno, posebno za aplikacije velike propusnosti.Druge metode termičkog prajminga koriste štit od voska za zatvaranje bitne komponente, uključujući magnezijeve ione ili enzime, ili za fizičku izolaciju reaktivnih komponenti, kao što su šabloni i puferi.Tokom termičkog ciklusa, različite komponente se oslobađaju i miješaju zajedno dok se vosak topi.Kao i metoda ručnog vrućeg pokretanja, metoda zaštite od voska je glomazna i sklona kontaminaciji i nije prikladna za aplikacije velike propusnosti.
Platinum DNK polimeraza je zgodna i efikasna za automatski hot start PCR.Platinum Taq DNK polimeraza se sastoji od rekombinantne Taq DNK polimeraze u kombinaciji s monoklonskim antitijelima protiv Taq DNK polimeraze.Antitela su formulisana PCR-om da inhibiraju aktivnost enzima tokom dužeg održavanja temperature.Taq DNK polimeraza je puštena u reakciju tokom 94℃ izolacije koraka denaturacije, vraćajući punu aktivnost polimeraze.Za razliku od hemijski modifikovane Taq DNK polimeraze za termičku inicijaciju, platinasti enzim ne zahteva produženu izolaciju na 94℃ (10 do 15 minuta) da bi aktivirao polimerazu.Sa PlatinumTaq DNK polimerazom, 90% aktivnosti Taq DNK polimeraze je obnovljeno nakon 2 minute na 94℃.
11. Nest-PCR
Uzastopni krugovi amplifikacije korištenjem ugniježđenih prajmera mogu poboljšati specifičnost i osjetljivost.Prvi krug je standardno pojačanje od 15 do 20 ciklusa.Mali dio inicijalnog proizvoda amplifikacije razrijeđen je 100 do 1000 puta i dodan u drugi krug amplifikacije u 15 do 20 ciklusa.Alternativno, početni amplificirani proizvod može se odrediti pročišćavanjem gela.U drugom krugu amplifikacije koristi se ugniježđeni prajmer, koji se može vezati za ciljnu sekvencu unutar prvog prajmera.Upotreba ugniježđenog PCR-a smanjuje mogućnost amplifikacije višestrukih ciljnih mjesta jer postoji nekoliko ciljnih sekvenci komplementarnih oba seta prajmera.Isti ukupan broj ciklusa (30 do 40) sa istim prajmerima je pojačao nespecifična mesta.Ugniježđeni PCR povećava osjetljivost ograničenih ciljnih sekvenci (npr. rijetke mrnas) i poboljšava specifičnost teškog PCRS-a (npr. 5′ RACE).
12. Descendentni PCR
Opadajući PCR poboljšava specifičnost korištenjem strogih uvjeta žarenja za prvih nekoliko ciklusa PCR-a.Ciklus počinje pri temperaturi žarenja približno 5℃ višoj od procijenjene Tm, a zatim se svaki ciklus smanjuje za 1℃ do 2℃ sve dok temperatura žarenja ne padne ispod Tm 5℃.Samo odredišni predložak s najvećom homologijom će biti pojačan.Ovi proizvodi nastavljaju da se šire u narednim ciklusima, istiskujući pojačane nespecifične proizvode.Descendentni PCR je koristan za metode kod kojih stepen homologije između prajmera i ciljnog šablona nije poznat, kao što je AFLP DNK otisak prsta.
Povezani PCR kompleti
2× PCR herojTMMix sistem ima veću toleranciju na PCR inhibitore od običnog PCR Mix sistema i lako se nosi sa PCR amplifikacijom različitih složenih šablona.Jedinstveni sistem reakcije i Taq Hero visoke efikasnosti čine da PCR reakcija ima veću efikasnost amplifikacije, specifičnost i osjetljivost.
Veća efikasnost pojačanja
Ima aktivnost 5'→3' DNK polimeraze i 5'→3' egzonukleazne aktivnosti, bez aktivnosti 3'→5' egzonukleaze.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Specifično—optimizirani pufer i Taq enzim s vrućim startom mogu spriječiti nespecifično pojačavanje i formiranje dimera prajmera
Visoka osjetljivost—može otkriti male kopije šablona
Komplet koristi jedinstveni Foregene reagens reverzne transkripcije i Foregene HotStar Taq DNK polimerazu u kombinaciji sa jedinstvenim reakcionim sistemom za efikasno poboljšanje efikasnosti amplifikacije i specifičnosti reakcije.
Vrijeme objave: 09.05.2023
