RT-qPCR je razvijen od obične PCR tehnologije.On dodaje fluorescentne hemikalije (fluorescentne boje ili fluorescentne sonde) tradicionalnom PCR reakcijskom sistemu i detektuje PCR proces žarenja i proširenja u realnom vremenu prema njihovim različitim luminiscentnim mehanizmima.Promjene fluorescentnog signala u mediju koriste se za izračunavanje količine promjene proizvoda u svakom ciklusu PCR-a.Trenutno, najčešće metode su metoda fluorescentne boje i metoda sonde.

Metoda fluorescentne boje:
Neke fluorescentne boje, kao što su SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, itd., ne emituju svjetlost same po sebi, već emituju fluorescenciju nakon vezivanja za manji žljeb dsDNK.Stoga, na početku PCR reakcije, mašina ne može detektovati fluorescentni signal.Kada reakcija pređe na fazu produžetka žarenja (metoda u dva koraka) ili fazu proširenja (metoda u tri koraka), dvostruki lanci se otvaraju u ovom trenutku, a nova DNK polimeraza Tokom sinteze lanca, fluorescentni molekuli se kombinuju u manjem žljebu dsDNA i emituju fluorescenciju.Kako se broj PCR ciklusa povećava, sve više i više boja se kombinuje sa dsDNK, a fluorescentni signal se takođe kontinuirano povećava.Uzmimo SYBR Green Ⅰ kao primjer.
Metoda sonde:
Taqman sonda je najčešće korištena sonda za hidrolizu.Na 5′ kraju sonde nalazi se fluorescentna grupa, obično FAM.Sama sonda je sekvenca komplementarna ciljnom genu.Na 3′ kraju fluorofora nalazi se fluorescentna grupa za gašenje.Prema principu prijenosa energije fluorescentne rezonancije (Förster rezonantni prijenos energije, FRET), kada reporterska fluorescentna grupa (donorska fluorescentna molekula) i gaseća fluorescentna grupa (akceptorska fluorescentna molekula) Kada se ekscitacijski spektar preklapa i udaljenost je vrlo bliska, fluorescentna molekula može prerasti (7-10). molekula akceptora, dok je autofluorescencija oslabljena.Stoga, na početku PCR reakcije, kada je sonda slobodna i netaknuta u sistemu, reporterska fluorescentna grupa neće emitovati fluorescenciju.Prilikom žarenja, prajmer i sonda se vezuju za šablon.Tokom faze ekstenzije, polimeraza kontinuirano sintetiše nove lance.DNK polimeraza ima aktivnost 5′-3′ egzonukleaze.Kada stigne do sonde, DNK polimeraza će hidrolizirati sondu iz šablona, ​​odvojiti reportersku fluorescentnu grupu od fluorescentne grupe gasitelja i osloboditi fluorescentni signal.Pošto postoji odnos jedan-na-jedan između sonde i šablona, ​​metoda sonde je superiornija od metode bojenja u smislu tačnosti i osjetljivosti testa.

Slika 1 Princip qRT-PCR

Dizajn prajmera
principi:

Prajmeri treba da budu dizajnirani u očuvanom regionu serije nukleinskih kiselina i da imaju specifičnost.

Najbolje je koristiti cDNK sekvencu, a mRNA sekvenca je također prihvatljiva.Ako nije, saznajte dizajn cds regije DNK sekvence.
Dužina fluorescentnog kvantitativnog proizvoda je 80-150bp, najduža je 300bp, dužina prajmera je općenito između 17-25 baza, a razlika između uzvodnog i nizvodnog prajmera ne bi trebala biti prevelika.

Sadržaj G+C je između 40% i 60%, a najbolje je 45-55%.
Vrijednost TM je između 58-62 stepena.
Pokušajte izbjeći dimere prajmera i samodimere, (ne pojavljuju se više od 4 para uzastopnih komplementarnih baza) struktura ukosnice, ako je neizbježna, napravite ΔG<4,5kJ/mol* Ako ne možete osigurati da je gDNK uklonjena tokom reverzne transkripcije Očistite, najbolje je dizajnirati prajmere introna, a kraj introna ne može izbjeći T/C′ region da ne bude modificiran *3′ C, A/G kontinualne strukture (2-3) prajmera i ne-
specifična Homologija heterogeno amplificirane sekvence je poželjno manja od 70% ili ima 8 komplementarnih baznih homologija.
baza podataka:
CottonFGD pretraživanje po ključnim riječima
Dizajn prajmera:
Dizajn IDT-qPCR prajmera

Slika 2 IDT stranica sa online alatom za dizajn prajmera

Slika 3 Prikaz stranice rezultata
Dizajn lncRNA prajmera:
lncRNA:isti koraci kao mRNA.
miRNA:Princip metode matične petlje: Budući da su sve miRNA kratke sekvence od oko 23 nt, direktna PCR detekcija se ne može izvesti, pa se koristi alat za sekvencu stabljične petlje.Sekvenca petlje stabljike je jednolančana DNK od oko 50 nt, koja sama može formirati strukturu ukosnice.3 'Kraj se može dizajnirati kao sekvenca komplementarna djelomičnom fragmentu miRNA, zatim se ciljna miRNA može povezati sa sekvencom petlje stabla tokom reverzne transkripcije, a ukupna dužina može doseći 70bp, što je u skladu s dužinom amplificiranog proizvoda određenom qPCR-om.Tailing miRNA prajmer dizajn.
Detekcija specifična za pojačanje:
Online baza podataka eksplozije: CottonFGD eksplozija po sličnosti sekvence
Lokalna eksplozija: Pogledajte korištenje Blast+ za lokalno blast, linux i macos mogu direktno uspostaviti lokalnu bazu podataka, win10 sistem se također može uraditi nakon instaliranja ubuntu bash-a.Kreirajte lokalnu bazu podataka o eksplozijama i lokalnu eksploziju;otvorite ubuntu bash na win10.
Napomena: planinski pamuk i pamuk s morskih ostrva su tetraploidne kulture, tako da će rezultat eksplozije često biti dva ili više podudaranja.U prošlosti, korištenje NAU CD-a kao baze podataka za izvođenje eksplozije vjerovatno će pronaći dva homologna gena sa samo nekoliko SNP razlika.Obično se dva homologna gena ne mogu razdvojiti dizajnom prajmera, pa se tretiraju kao isti.Ako postoji očigledan indel, prajmer se obično dizajnira na indelu, ali to može dovesti do sekundarne strukture prajmera. Slobodna energija postaje veća, što dovodi do smanjenja efikasnosti amplifikacije, ali to je neizbežno.

Detekcija sekundarne strukture prajmera:
Koraci:otvori oligo 7 → unesi sekvencu šablona → zatvori podprozor → sačuvaj → lociraj prajmer na šablonu, pritisnite ctrl+D da postaviš dužinu prajmera → analiziraj različite sekundarne strukture, kao što su samodimerizaciono telo, heterodimer, ukosnica, neslaganje, itd. Poslednje dve slike na slici 4 su rezultati testa prajmera.Rezultat prednjeg prajmera je dobar, nema očigledne strukture dimera i ukosnice, nema kontinuiranih komplementarnih baza, a apsolutna vrijednost slobodne energije je manja od 4,5, dok stražnji prajmer pokazuje kontinuirano 6 baza je komplementarno, a slobodna energija je 8,8;osim toga, na 3′ kraju se pojavljuje ozbiljniji dimer, a pojavljuje se i dimer od 4 uzastopne baze.Iako slobodna energija nije visoka, 3′ dimer Chl može ozbiljno uticati na specifičnost amplifikacije i efikasnost amplifikacije.Osim toga, potrebno je provjeriti ima li ukosnica, heterodimera i neusklađenosti.

Slika 3 rezultati detekcije oligo7
Detekcija efikasnosti pojačanja:
Efikasnost amplifikacije PCR reakcije ozbiljno utiče na PCR rezultate.Takođe u qRT-PCR, efikasnost amplifikacije je posebno važna za kvantitativne rezultate.Uklonite druge supstance, mašine i protokole u reakcijskom puferu.Kvalitet prajmera takođe ima veliki uticaj na efikasnost amplifikacije qRT-PCR.Da bi se osigurala tačnost rezultata, i kvantifikacija relativne fluorescencije i kvantifikacija apsolutne fluorescencije treba da otkriju efikasnost amplifikacije prajmera.Poznato je da je efektivna efikasnost qRT-PCR amplifikacije između 85% i 115%.Postoje dvije metode:
1. Standardna metoda krivulje:
a.Pomiješajte cDNK
b.Gradijentno razrjeđivanje
c.qPCR
d.Jednačina linearne regresije za izračunavanje efikasnosti pojačanja
2. LinRegPCR
LinRegPCR je program za analizu RT-PCR podataka u realnom vremenu, koji se takođe nazivaju kvantitativni PCR (qPCR) podaci zasnovani na SYBR Green ili sličnoj hemiji.Program koristi podatke koji nisu korigovani na osnovu osnovne linije, vrši korekciju osnovne linije na svakom uzorku odvojeno, određuje prozor linearnosti i zatim koristi analizu linearne regresije da uklopi ravnu liniju kroz PCR skup podataka.Iz nagiba ove linije izračunava se PCR efikasnost svakog pojedinačnog uzorka.Srednja efikasnost PCR po amplikonu i Ct vrijednost po uzorku se koriste za izračunavanje početne koncentracije po uzorku, izražene u proizvoljnim jedinicama fluorescencije.Unos i izlaz podataka se vrši preko Excel tabele.Samo uzorak
miješanje je potrebno, bez gradijenta
potrebni su koraci:(Uzmite Bole CFX96 kao primjer, ne baš Mašina sa jasnim ABI)
eksperiment:to je standardni qPCR eksperiment.
qPCR izlaz podataka:LinRegPCR može prepoznati dva oblika izlaznih datoteka: RDML ili kvantifikacijski rezultat amplifikacije.Zapravo, to je vrijednost detekcije u realnom vremenu broja ciklusa i signala fluorescencije od strane mašine, a pojačanje se dobija analizom vrijednosti promjene fluorescencije efikasnosti linearnog segmenta.
Odabir podataka: U teoriji, RDML vrijednost bi trebala biti upotrebljiva.Procjenjuje se da je problem mog računala taj što softver ne može prepoznati RDML, pa imam izlaznu vrijednost excel kao originalni podatak.Preporučljivo je prvo izvršiti grubi pregled podataka, kao što je neuspjeh pri dodavanju uzoraka, itd. Tačke se mogu izbrisati u izlaznim podacima (naravno, ne možete ih izbrisati, LinRegPCR će zanemariti ove točke u kasnijoj fazi)

Slika 5 qPCR izvoz podataka

Slika 6 izbor uzoraka kandidata

Unos podataka:Otvorite rezultate amplifikacije kvalifikacija.xls, → otvorite LinRegPCR → datoteku → pročitajte iz excela → odaberite parametre kao što je prikazano na slici 7 → OK → kliknite odredite osnovne linije

Slika 7 koraka unosa linRegPCR podataka

rezultat:Ako nema ponavljanja, nije potrebno grupisanje.Ako postoji ponavljanje, grupisanje se može urediti u grupisanju uzoraka, a ime gena se upisuje u identifikator, a zatim će isti gen biti automatski grupisan.Na kraju, kliknite na datoteku, izvezite excel i pogledajte rezultate.Efikasnost amplifikacije i rezultati R2 za svaku jažicu će biti prikazani.Drugo, ako se podijelite u grupe, ispravljena prosječna efikasnost pojačanja će biti prikazana.Osigurajte da je efikasnost amplifikacije svakog prajmera između 85% i 115%.Ako je prevelika ili premala, to znači da je efikasnost prajmera slaba.

Slika 8 Rezultat i izlaz podataka

Eksperimentalni proces:
Zahtevi za kvalitet RNK:
čistoća:1.72.0 ukazuje da može postojati rezidualni izotiocijanat.Čista nukleinska kiselina A260/A230 bi trebala biti oko 2 . Ako postoji jaka apsorpcija na 230 nm, to ukazuje da postoje organska jedinjenja kao što su fenatni joni.Osim toga, može se otkriti elektroforezom u 1,5% agaroznom gelu.Postavite marker, jer ssRNA nema denaturaciju i logaritam molekulske težine nema linearnu vezu, a molekulska težina se ne može ispravno izraziti.Koncentracija: Teoretskinemanje od 100 ng/ul, ako je koncentracija preniska, čistoća je općenito niska, a ne visoka

Fig9 RNA gel

Osim toga, ako je uzorak dragocjen i koncentracija RNK visoka, preporučuje se da se nakon ekstrakcije uzme u alikvot, a RNK razrijedi do konačne koncentracije od 100-300 ng/ul za reverznu transkripciju.Uproces reverzne transkripcije, kada se mRNA transkribuje, oligo (dt) prajmeri koji se mogu specifično vezati za polyA repove koriste se za reverznu transkripciju, dok lncRNA i circRNA koriste nasumične heksamerske (Random 6 mer) prajmere za reverznu transkripciju ukupne RNK.Mnoge kompanije su sada lansirale posebne komplete za praćenje.Za metodu matične petlje, metoda tailing je pogodnija, ima visoku propusnost i štedi reagense, ali efekat razlikovanja miRNA iz iste porodice ne bi trebao biti tako dobar kao metoda matične petlje.Svaki komplet za reverznu transkripciju ima zahtjeve za koncentraciju gen-specifičnih prajmera (stem-loops).Interna referenca koja se koristi za miRNA je U6.U procesu inverzije stabljike i petlje, epruvetu U6 treba posebno preokrenuti, a prednji i zadnji prajmer U6 treba direktno dodati.I circRNA i lncRNA mogu koristiti HKG kao internu referencu.UcDNK detekcija,
ako nema problema sa RNK, cDNK bi takođe trebao biti u redu.Međutim, ako se teži savršenstvu eksperimenta, najbolje je koristiti interni referentni gen (Referentni gen, RG) koji može razlikovati gDNK od CD-a.Generalno, RG je gen za održavanje kućanstva., HKG) kao što je prikazano na slici 10;U to vrijeme sam pravio protein za skladištenje od soje i koristio introne koji sadrže aktin7 kao internu referencu.Veličina amplificiranog fragmenta ovog prajmera u gDNK bila je 452bp, a ako je cDNA korištena kao šablon, bila je 142bp.Zatim su rezultati testa otkrili da je dio cDNK zapravo kontaminiran gDNK, a također je dokazano da nema problema s rezultatom reverzne transkripcije, te se može koristiti kao šablon za PCR.Beskorisno je izvoditi elektroforezu u agaroznom gelu direktno sa cDNK, a radi se o difuznom pojasu, što nije uvjerljivo.

Slika 10 Detekcija cDNK

Određivanje qPCR uslovageneralno nije problem prema protokolu kompleta, uglavnom u koraku tm vrijednosti.Ako neki prajmeri nisu dobro dizajnirani tokom dizajna prajmera, što rezultira velikom razlikom između vrijednosti tm i teoretskih 60°C, preporučuje se da cDNK nakon što su uzorci pomiješani, izvrši gradijentni PCR sa prajmerima i pokuša izbjeći postavljanje temperature bez traka kao TM vrijednost.

Analiza podataka

Konvencionalna metoda kvantitativne PCR obrade relativne fluorescencije je u osnovi prema 2-ΔΔCT.Šablon za obradu podataka.

Srodni proizvodi:

PCR u realnom vremenu jednostavno^TM –Taqman

PCR u realnom vremenu jednostavno^TM –SYBR ZELENI I

RT Easy I (Master Premix za sintezu prvog lanca cDNK)

RT Easy II (Master Premix za sintezu prvog lanca cDNK za qPCR)