RT-qPCR je osnovni eksperiment molekularne biologije i svi moraju biti upoznati s njim.Uglavnom uključuje tri koraka: ekstrakciju RNK, reverznu transkripciju u cDNK i fluorescentni kvantitativni PCR u realnom vremenu.Ne pomaže, šta se dešava?Vjerovatno je da postoji problem saeksperiment reverzne transkripcije!Iako se čini da eksperiment reverzne transkripcije treba samo dodati RNA, dNTP, prajmere ireverzna transkriptazau epruvetu za centrifugu i dobro promiješati, ali u samom procesu rada još uvijek ima mnogo detalja na koje treba obratiti pažnju.Hajde da naučimo o tome!

Kako proceniti kvalitet RNK?
Za dobijanje cDNK, kvalitet RNK je kritičan!Kvalitet RNK može se otkriti uglavnom iz dva aspekta:
(1) Integritet RNK:Integritet RNK se može potvrditi elektroforezom u agaroznom gelu. Uzimajući eukariote kao primjer, kompletna ukupna RNK ima tri jasne trake, molekularne težine od velikih do malih su 28S, 18S i 5S, a 28S je dvostruko svjetlija od 18S;ako se mogu vidjeti tri trake, ali je tip trake zamagljen ili Difuzija znači da je RNA djelomično degradirana.U ovom trenutku, odmah izvršite reakciju obrnute transkripcije i povećajte unos šablona na odgovarajući način;ako se može vidjeti samo traka s malom molekulskom težinom ili nijedna traka, RNK je potpuno degradirana i treba je ponovo ekstrahirati.Agilent 2100 ukazuje na integritet RNK dijagramom pikova i RIN vrijednošću.Ako je nukleinska kiselina netaknuta, osnovna linija elektroferograma je ravna;ako je nukleinska kiselina ozbiljno razgrađena, osnovna linija je neujednačena i pojavljuje se više vrhova razgradnje;vrijednost RIN odražava integritet RNK, u rasponu od 0-10, što je veća vrijednost, to je bolji kvalitet RNK.Pa, što je veći stepen kompletnosti.
(2) Čistoća RNK:Odnos OD260/280 može se detektovati UV spektrofotometrijom.Ako je omjer OD260/280 između 1,9 i 2,1, čistoća je vrlo dobra.
Preostala genomska DNK može dovesti do netačnih kvantitativnih rezultata
Kada se RNK ekstrahuje, RNK koju dobijemo može biti pomešana sa genomskom DNK (gDNK) koja nije očišćena.Stoga će cDNK nakon reverzne transkripcije također biti pomiješana sagDNK.Tokom nizvodnoqPCRreakcija,cDNKi gDNK mogu biti amplificirani istovremeno, što rezultira relativno malom CT vrijednosti, tako da rezultati mogu biti pristrasni.
Šta da radimo u ovoj situaciji?Foregenepredlaže:
(1) Izvršiti čišćenje genoma na obrnutoj RNK, koja se može ukloniti ekstrakcijom kolone tokom ekstrakcije RNK;
(2) Tretirajte ekstrahovanu RNK sa DNazomI , ali ga završite sa EDTA;
reagensa za reverznu transkripcijusa modulima za čišćenje genoma;

Kako odabrati prajmere za reverznu transkripciju?
Prajmeri reverzne transkripcije takođe utiču na ishod reakcije reverzne transkripcije.Možete odabrati nasumične prajmere, Oligo dT ili gen-specifične prajmere za reverznu transkripciju u skladu sa specifičnim okolnostima eksperimenta:
(1) Specifični transkripti: preporučuju se genski specifični prajmeri;
(2) Dugi fragment transkripta: Oligo dT/genski specifični prajmeri se preporučuju;
(3) Unutrašnji fragmenti transkripata dugog segmenta: genski specifični prajmeri/ nasumični prajmeri / nasumični prajmeri + Oligo dT.Ako se izvrši naknadni qPCR eksperiment, Oligo dT se ne može koristiti sam, jer korištenje samog Oligo dT-a može uzrokovati 3′ end bias, što dovodi do netačnih rezultata qPCR eksperimenta;
(4) miRNA: Mogu se koristiti prajmeri u obliku petlje ili repa.

Koliko puta treba razrijediti cDNK produkta reverzne transkripcije radi kvantifikacije?
Nakon dobijanja cDNK proizvoda reverzne transkripcije, veoma je važno koliko puta cDNK treba razrijediti za qPCR eksperimente.Ako je koncentracija cDNK previsoka ili preniska, to može uticati na efikasnost amplifikacije.Može li se koncentracija cDNK izmjeriti i kako to učiniti?
(1) Koncentracija cDNK produkta reverzne transkripcije ne može se izmjeriti, jer osim proizvoda obrnute transkripcije, proizvod reverzne transkripcije također sadrži pufer zaostalog reverzne transkripcije, reverznu transkriptazu, prajmere, itd., što će ometati rezultate mjerenja koncentracije i uzrokovati OD260/280, OD260/ OD260 omjer ne odražava normalan odnos cd2.U ovo vrijeme, neki prijatelji će reći, onda ću izmjeriti koncentraciju nakon pročišćavanja;ovdje Foregene želi podsjetiti da se cDNK ne preporučuje za pročišćavanje, jer je dužina cDNK dobijene preokretom drugačija, a kratka cDNK će se izgubiti u prečišćavanju.
(2) Dakle, šta učiniti?Prije qPCR eksperimenta, gradijent razrjeđenja cDNK može se odrediti putem pre-eksperimenta.Na primjer: koristite osnovni rastvor cDNA, 10-struko razrjeđenje i 100-struko razrjeđenje kao šablone za qPCR eksperimente i odaberite faktor razrjeđenja sa CT vrijednošću u rasponu od 18-28.

Kako se miRNA treba reverzno transkribovati?
miRNA je jednolančana RNA malih molekula veličine oko 22 nt koja ne kodira protein.Zbog svoje kratke dužine, konvencionalnu qPCR metodu je teško direktno kvantificirati, pa je često potrebno proširiti miRNA;najčešće korištene metode reverzne transkripcije za miRNA uključuju metodu matične petlje i metodu repa.
Metoda matične petlje je proširenje miRNA dodavanjem prajmera petlje stabla.Ova metoda detekcije ima veću osjetljivost i specifičnost, ali je propusnost detekcije niska.Jedna reverzna transkripcija može otkriti samo jednu miRNA i internu referencu;metoda dodavanja repa sastoji se od dva. Završava se zajedničkim djelovanjem dva enzima, a to su PoliA polimeraza i reverzna transkriptaza.PolyA polimeraza je odgovorna za dodavanje PolyA repova miRNA kako bi se povećala njena dužina, a reverzna transkriptaza izvodi reakciju reverzne transkripcije.Ova metoda ima visoku propusnost detekcije i može otkriti više miRNA i internih referenci u jednoj obrnutoj transkripciji, ali su osjetljivost i specifičnost niske u metodi matične petlje.