PCR u realnom vremenu, također poznat kao kvantitativni PCR ili qPCR, je metoda za praćenje i analizu proizvoda PCR amplifikacije u realnom vremenu.
Budući da kvantitativni PCR ima prednosti jednostavnog rada, brzog i praktičnog, visoke osjetljivosti, dobre ponovljivosti i niske stope kontaminacije, široko se koristi u medicinskom testiranju, procjeni efikasnosti lijekova, istraživanju ekspresije gena, transgenom istraživanju, detekciji gena, otkrivanju patogena, otkrivanju životinja i biljaka., testiranje hrane i druga polja.
Dakle, bilo da se bavite osnovnim istraživanjima u životnim naukama, ili ste zaposleni u farmaceutskim kompanijama, stočarskim kompanijama, prehrambenim kompanijama, pa čak i zaposlenima u biroima za ulazno-izlaznu inspekciju i karantin, odjelima za praćenje okoliša, bolnicama i drugim jedinicama, bit ćete manje ili više izloženi Ili trebate znati znanje o savladavanju kvantitativnog PCR-a.

Princip PCR u realnom vremenu

PCR u realnom vremenu je metoda u kojoj se fluorescentnim supstancama dodaju u PCR reakcijski sistem, a intenzitet signala fluorescencije u procesu PCR reakcije se prati u realnom vremenu kvantitativnim PCR instrumentom, a na kraju se analiziraju i obrađuju eksperimentalni podaci.

【Kriva pojačanja】je kriva koja opisuje dinamički proces PCR-a.Kriva amplifikacije PCR-a zapravo nije standardna eksponencijalna kriva, već sigmoidna kriva.

[Platformska faza krivulje pojačanja]Sa povećanjem broja PCR ciklusa, inaktivacijom DNK polimeraze, iscrpljivanjem dNTP-a i prajmera, i inhibicijom reakcije sinteze nusproizvodom reakcije pirofosfatom, itd., PCR se ne širi uvijek eksponencijalno., i na kraju će ući u plato.

[Krivulja eksponencijalnog rasta regije amplifikacije]Iako plato faza uveliko varira, u određenom području eksponencijalnog područja rasta krivulje amplifikacije, ponovljivost je vrlo dobra, što je vrlo važno za kvantitativnu analizu PCR-a.

[Vrijednost praga i Ct vrijednost]Postavili smo graničnu vrijednost detekcije fluorescencije na odgovarajuću poziciju u području eksponencijalnog rasta krivulje amplifikacije, odnosno graničnu vrijednost (Threshold).Presjek vrijednosti praga i krive pojačanja je vrijednost Ct, odnosno vrijednost Ct se odnosi na broj ciklusa (Threshold Cycle) kada se dostigne vrijednost praga.

Grafikon ispod jasno pokazuje odnos između linije praga i krive pojačanja, praga i Ct vrijednosti.

【Kako kvantificirati?】

Matematičkom teorijom je dokazano da vrijednost Ct ima inverznu linearnu vezu sa logaritmom broja početnih šablona.PCR u realnom vremenu prati proizvode PCR amplifikacije u realnom vremenu i kvantificira ih tokom faze eksponencijalne amplifikacije.

Za svaki ciklus PCR-a, DNK se eksponencijalno povećavala za 2 puta i ubrzo dostigla plato.

Pod pretpostavkom da je količina početne DNK A₀ , nakon n ciklusa, teoretska količina DNK proizvoda može se izraziti kao:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Zatim, što je veća početna količina DNK A 0, to prije količina amplificiranog proizvoda dostigne vrijednost detekcije An, a broj ciklusa kada se postigne An je vrijednost Ct.Odnosno, što je početna količina DNK A 0 veća, to je kriva amplifikacije ranije dostigla vrhunac, a time je i potreban broj ciklusa n manji.

Provodimo gradijentno razrjeđivanje standarda poznate koncentracije i koristimo ga kao šablon za PCR u realnom vremenu, a serija krivulja amplifikacije će se dobiti u jednakim intervalima po redoslijedu početne količine DNK od više do manje.Prema linearnom odnosu između vrijednosti Ct i logaritma broja početnih šablona, ​​a[standardna kriva] može se kreirati.

Zamjenom Ct vrijednosti uzorka nepoznate koncentracije u standardnu ​​krivu, može se dobiti početna šablonska količina uzorka nepoznate koncentracije, što je kvantitativni princip PCR u realnom vremenu.

Metoda detekcije PCR u realnom vremenu

PCR u realnom vremenu detektuje produkte PCR amplifikacije detekcijom intenziteta fluorescencije u reakcionom sistemu.

Princip metode ugradnje fluorescentne boje】

Fluorescentne boje, kao što je TB Green ® , može se nespecifično vezati za dvolančanu DNK u PCR sistemima i fluorescirati nakon vezivanja.

Intenzitet fluorescencije u reakcionom sistemu eksponencijalno se povećavao sa povećanjem PCR ciklusa.Detekcijom intenziteta fluorescencije, količina DNK amplifikacije u reakcionom sistemu može se pratiti u realnom vremenu, a zatim se količina početnog šablona u uzorku može obrnuto procijeniti.

【Princip metode fluorescentne sonde】

fluorescentna sondaje sekvenca nukleinske kiseline sa fluorescentnom grupom na 5′ kraju i grupom za gašenje na 3′ kraju, koja se može specifično vezati za šablon.Kada je sonda netaknuta, fluorescenciju koju emituje fluorofor gasi grupa za gašenje i ne može fluorescirati.Kada se sonda razgradi, fluorescentna supstanca će se disocirati i emitovati fluorescenciju.

Fluorescentna sonda se dodaje u PCR reakcijski rastvor.Tokom procesa žarenja, fluorescentna sonda će se vezati za specifičnu poziciju šablona.Tokom procesa ekstenzije, aktivnost 5′→3′ egzonukleaze enzima PCR može razgraditi fluorescentnu sondu hibridiziranu sa šablonom, a fluorescentna supstanca se disocira da emituje fluorescenciju.Određivanjem intenziteta fluorescencije sonde u reakcionom sistemu, može se postići svrha praćenja količine amplifikacije PCR proizvoda.

【Odabir metode detekcije fluorescencije】

Ako se koristi za razlikovanje sekvenci sa visokom homologijom i izvođenje multipleks PCR detekcije kao što je analiza SNP tipizacije, metoda fluorescentne sonde je nezamjenjiva.
Za druge PCR eksperimente u realnom vremenu može se koristiti jednostavna, laka i jeftina metoda fluorescentne himere.

sonde Snažne specifičnosti, sposobne za multipleks PCR

Nedostatak

Visoki zahtjevi specifičnosti za amplifikaciju;

multipleks PCR se ne može izvesti Potreba za dizajniranjem specifičnih sondi, visoka cijena;

ponekad je dizajn sonde težak

Srodni proizvodi: