U qPCR eksperimentima, dizajn prajmera je takođe veoma važna karika.Da li su prajmeri prikladni ili ne usko je povezano s tim da li efikasnost amplifikacije dostiže standard, da li su pojačani proizvodi specifični i da li su eksperimentalni rezultati dostupni.
Dakle, kako poboljšati specifičnost qPCR prajmera?Visoka efikasnost pojačanja?
Danas ćemo vas odvesti da zajedno dizajnirate qPCR prajmere i dopustite da dizajn qPCR prajmera postane efikasna vještina znanja u eksperimentima.
Prilikom dizajniranja qPCR prajmera, obično obratite pažnju na sljedeće točke: prajmeri bi trebali biti dizajnirani preko introna što je više moguće, dužina proizvoda bi trebala biti 100-300 bp, vrijednost Tm bi trebala biti što bliže 60°C, a uzvodni i nizvodni prajmeri bi trebali biti što je moguće bliže, a kraj prajmera treba biti G ili C, itd.
1. Dizajn prajmera koji obuhvata introne
Prilikom dizajniranja qPCR prajmera, odabir prajmera dizajniranih preko introna može spriječiti amplifikaciju gDNK šablona, ​​a svi proizvodi su izvedeni iz amplifikacije cDNK, čime se eliminira utjecaj kontaminacije gDNK.
2. Dužina prajmera
Dužina prajmera je generalno između 18-30 nt, a dužina amplifikacije treba kontrolisati između 100-300 bp koliko god je to moguće.
Ako je prajmer prekratak, to će dovesti do nespecifičnog pojačanja, a ako je predugačak, lako će formirati sekundarnu strukturu (kao što je struktura ukosnice).Ako je proizvod amplifikacije predugačak, nije pogodan za reakciju polimeraze, što će uticati na efikasnost PCR amplifikacije.
3. GC sadržaj i Tm vrijednost
Sadržaj GC prajmera treba kontrolisati između 40% i 60%.Ako je previsok ili prenizak, nije pogodan za pokretanje reakcije.Sadržaj GC-a u prednjem i obrnutom prajmeru trebao bi biti približno isti kako bi se dobila ista Tm vrijednost i temperatura žarenja.
Vrijednost Tm bi trebala biti između 55-65°C koliko god je to moguće, općenito oko 60°C, a vrijednost Tm uzvodno i nizvodno bi trebala biti što je moguće bliže, poželjno ne više od 4°C.
4. Izbjegavajte odabir A na 3′ kraju prajmera
Kada je 3′ kraj prajmera neusklađen, postoje velike razlike u efikasnosti sinteze različitih baza.Kada je posljednja baza A, ona također može pokrenuti lančanu sintezu čak i u slučaju neusklađenosti, a kada je posljednja baza T Kada je efikasnost indukcije neusklađenosti znatno smanjena.Stoga pokušajte izbjeći odabir A na 3′ kraju prajmera, a bolje je odabrati T.
Ako se radi o prajmeru sonde, 5′ kraj sonde ne može biti G, jer čak i kada je jedna G baza povezana sa FAM fluorescentnom reporterskom grupom, G također može ugasiti fluorescentni signal koji emituje FAM grupa, što rezultira lažno negativnim rezultatima.pojavi se.
5. Osnovna distribucija
Raspodjela četiri baze u prajmeru je poželjno nasumična, izbjegavajući više od 3 uzastopna G ili C na kraju 3′ i više od 3 uzastopnaG ili C je lako generisati uparivanje u regionu sekvence bogate GC.
6. Područje dizajna prajmera treba izbjegavati složene sekundarne strukture.
Sekundarna struktura formirana od jednog lanca produkta amplifikacije će uticati na nesmetan napredak PCR-a.Predviđanjem da li postoji sekundarna struktura u ciljnoj sekvenci unaprijed, pokušajte izbjeći ovu regiju u dizajnu prajmera.
7. Sami prajmeri i između prajmera treba da izbegavaju uzastopne komplementarne baze.
Ne može postojati 4 uzastopne komplementarnosti između samog prajmera i prajmera.Sam prajmer ne bi trebao imati komplementarnu sekvencu, inače će se sam savijati i formirati strukturu ukosnice, što će utjecati na kombinaciju prajmera i šablona za žarenje.
Komplementarne sekvence ne mogu postojati između uzvodnih i nizvodnih prajmera.Komplementarnost između prajmera će proizvesti dimere prajmera, što će smanjiti efikasnost PCR-a i čak uticati na kvantitativnu tačnost.Ako su strukture prajmera-dimera i ukosnica neizbežne, vrednost △G ne bi trebalo da bude previsoka (treba da bude manja od 4,5 kcal/mol).
8. Prajmeri pojačavaju ciljani specifični proizvod.
Krajnji cilj qPCR detekcije je razumjeti obilje ciljnog gena.Ako dođe do nespecifičnog pojačanja, kvantifikacija će biti netačna.Stoga, nakon što su prajmeri dizajnirani, potrebno ih je testirati od strane BLAST-a, a specifičnost proizvoda upoređivati ​​u bazi podataka sekvenci.
Zatim, uzimamo ljudski GAS6 (Growth Stop specific 6) gen kao primjer za dizajn qPCR prajmera.
01 upit gen
Homo GAS6preko NCBI.Ovdje bismo trebali obratiti pažnju na upoređivanje imena gena i vrste kako bismo bili sigurni da su konzistentni.
02 Pronađite sekvencu gena
(1) Ako je ciljna sekvenca genomska DNK, odaberite prvu, a to je sekvenca genomske DNK gena.
(2) Ako je ciljna sekvenca mRNA, odaberite drugu.Nakon unosa, kliknite na “CDS” u tabeli ispod.Smeđa pozadinska sekvenca je kodirajuća sekvenca gena.
03 Prajmeri za dizajn
Uđite u Primer-BLAST interfejs
Unesite redni broj gena ili sekvencu u Fasta formatu u gornjem lijevom kutu i popunite relevantne parametre.

Kliknite na “Get primers” i NCBI će se pojaviti da vam kaže da će takav izbor parametara biti pojačan na druge varijante spajanja.Možemo provjeriti različite varijante spajanja i poslati ih da dobijemo odgovarajući par prajmera (kao što je prikazano na slici ispod).Ovaj proces može potrajati nekoliko desetina sekundi.
Temperature žarenja ovih parova prajmera su oko 60°C.U skladu sa svrhom eksperimenta, birajte prajmere umjerene dužine, dobre specifičnosti i manje samokomplementacije prajmera za eksperiment, a uspješnost je prilično visoka!
04Provjera specifičnosti prajmera
U stvari, pored dizajna prajmera, Primer-Blast takođe može proceniti prajmere koje smo sami dizajnirali.Vratite se na stranicu za dizajn prajmera, unesite gornji i nizvodni prajmer koji smo dizajnirali, a ostali parametri se neće prilagođavati.Nakon slanja, možete vidjeti da li par prajmera postoji i na drugim genima.Ako su svi prikazani na genu koji želimo da pojačamo, što ukazuje da je specifičnost ovog para prajmera velika!(Na primjer, ovo je jedini rezultat osnovnog upita!)

05 Procjena kvaliteta prajmera
Kakva je vrsta prajmera „savršeni” prajmer koji kombinuje „efikasnost pojačanja do standarda”, „pojačane karakteristike proizvoda” i „pouzdane eksperimentalne rezultate”?
Efikasnost pojačanja

kriva topljenja
Efikasnost amplifikacije prajmera dostiže 90%-110%, što znači da je efikasnost amplifikacije dobra, a kriva topljenja ima jedan pik i obično Tm>80°C, što znači da je specifičnost amplifikacije dobra.
 
Srodni proizvodi:
PCR u realnom vremenu Easy–SYBR GREEN I
PCR u realnom vremenu Easy-Taqman