RNase je osjetljiva riječ koju mnogi studenti koji često provode eksperimente ekstrakcije RNK ne žele čuti.Potpuno naoružana, RNK koja je konačno ekstrahirana sa visoko toksičnim reagensima fenolom i kloroformom je razgrađena.Nisam se pomirio!!!Danas, hajde da pogledamo poreklo čuvene Rnase.

Ribonukleaza (RNase), ili RNaza, je nukleaza koja može hidrolizirati RNK u male molekule.RNaza, kao protein male molekule, neobično je stabilna .Konvencionalna sterilizacija parom na visokim temperaturama i visokim pritiskom i proteinski inhibitori ne mogu je potpuno inaktivirati.Stabilnost RNaze uglavnom dolazi od disulfidnih veza u strukturi.Na primjer, uobičajeno korištena RNKaza goveđeg pankreasa ima samo 124 aminokiseline, ali sadrži 4 disulfidne veze.Sumporna i disulfidna veza daju RNazu odličnu termičku stabilnost.Osim toga, rnaza ima relativno malu molekularnu težinu i može brzo vratiti svoju prvobitnu konformaciju u mnogim slučajevima.

Osim što je izuzetno stabilan,RNaze su sveprisutne u laboratoriji .RNaza je biološki odbrambeni mehanizam.Za ćeliju je egzogena RNK često fatalna.U poređenju sa egzogenom DNK, egzogena RNK je često opasnija.RNK se srećno transkribuje i prevodi, tako da su skoro svi organizmi razvili RNKaze za odbranu od invazije egzogene RNK.Stoga bakterijske ćelije uzgojene u laboratoriji i vi koji ekstrahirate RNK odiše aromom RNaze.Ljudske tjelesne tekućine (slina, suze, itd.) sadrže veliku količinu RNKaze, stoga nemojte plakati kada se RNK razgradi.Što više plačete, to je gora degradacija RNK!!Sestra Daiyu nije pogodna za ekstrakciju RNK!

Osim toga, vaša osjetljiva koža također sadrži mnogo RNase, a markeri, pipete, vrata frižidera i kvake koje je koža dodirnula također sadrže RNase.

Uz toliko lutanja, hajde da pogledamo kako da se nosimo sa RNasesima.

Prva stvar na koju svi pomisle kada uklanjaju RNK jeDEPC(dietil pirokarbonat).DEPC uglavnom denaturira protein kombinovanjem sa imidazolnim prstenom aktivne grupe histidina RNaze, čime inhibira aktivnost enzima.0,1% DEPC može imati bolji efekat uklanjanja na Rnazu, ali moramo obratiti pažnju da je DEPC poznati kancerogen, pa treba obratiti posebnu pažnju prilikom njegove upotrebe.

Za RNase, moramo početi od dva aspekta,prvi je da inhibira aktivnost endogene RNKaze

Konvencionalni reagensi za ekstrakciju RNK kao što su gvanidin izotiocijanat i DTT sadržani u Trizolu mogu otvoriti disulfidnu vezu RNKaze, ali još uvijek postoje neke RNaze, posebno u uzorcima tkiva, pa obratite pažnju na nisku temperaturu.

1.Uzorak tkiva odmah uronite u tečni dušik nakon što ga izvadite ili u komercijalni rastvor za konzervaciju RNK.

2.Nakon ekstrakcije RNA iz uzorka ćelije, dodajte je u rastvor za lizu i lizirajte na kutiji za led

3. Najbolje je koristiti tečni dušik za mljevenje kada su uzorci tkiva homogenizovani.Kada koristite električni homogenizator bez tekućeg dušika, obratite pažnju na potpuno prethodno hlađenje adaptera za homogenat.

Druga je egzogena DNaza

1.Budite potpuno naoružani, nosite laboratorijski mantil, nosite masku i obavezno nosite par novih rukavica (ne budite tako štedljivi!! Treba napomenuti da je Trizol super korozivan, a i kroz rukavice je jako jak, tako da ne kapa po rukama).

2.Svi korišteni vrhovi pipeta, EP epruvete, PCR epruvete i druga oprema moraju biti tretirani de-RNase.Može se natopiti u 0,1% DEPC, a zatim pod visokim pritiskom.Obratite pažnju na rad u haubi.Lokalni tirani mogu direktno kupiti potrošni materijal za uklanjanje enzima.

PS: Dozvolite mi da vam kažem lijenu metodu.Iako visoka temperatura i visoki pritisak ne mogu u potpunosti ukloniti RNazu, oni će ukloniti veliki dio nje.2 puta visoke temperature i visokog pritiska ima dobar efekat, a ekstrakcija RNK ima mali efekat.

3.Alkohol može denaturirati proteine,tako da se stol za ekstrakciju RNK može obrisati sa 75% alkohola , a rukavice se mogu poprskati i alkoholom.

4.Konačnu otopinu za otapanje RNK i epruvetu za centrifugu također treba tretirati de-RNase.DEPC voda je uobičajena otopina za otapanje RNK.Hajde da razgovaramo o ispravnom načinu pripreme DEPC vode (ne zaboravite da prepakujete komercijalni DEPC kada ga kupite)

Dodajte DEPC ultračistoj vodi na 1:1000, dobro promućkajte, ostavite da stoji preko noći na 37°C i sterilizirajte na 121°C pod visokom temperaturom i visokim pritiskom 15 minuta.DEPC voda se može čuvati na -20°C u alikvotima od 1ml.

Konačno, da sumiramo: niska temperatura je ključ, potrošni materijal se dobro rukuje, potpuno naoružani i manje priče!

E, to je to za današnju strategiju.Želim vam svu koncentraciju i čistoću RNK koju ste spomenuli.Oba A260/A280 su 2.0!!!

Naravno, ako koristite aRad na sobnoj temperaturi komplet za ekstrakciju RNK, možda nećete naići na gore navedene probleme.

Rad na sobnoj temperaturi, bez dodavanja DNaze, ekstrahuje ukupnu RNK iz ćelija za 11 minuta, a ekstrahuje ukupnu RNK iz životinjskih tkiva ili biljaka za 30 minuta.

Za probne uzorke kontaktirajte:overseas@foregene.com

Srodni proizvodi:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/