Tradicionalne reverzne transkriptaze ne mogu tolerisati visoke temperature (optimalna temperatura za aktivnost MMLV je 37-50°C, a AMV 42-60°C).Složenija virusna RNK ne može se efikasno reverzno transkribovati u cDNK na niskim temperaturama, što rezultira efikasnošću detekcije.Tradicionalni RT-qPCR generalno zahteva učešće dva ključna enzima (reverzna transkriptaza i DNK polimeraza), što onemogućava pojednostavljenje rada reakcionog sistema i smanjenje troškova.Ovdje ćemo predstaviti dvije reverzne transkriptaze otporne na visoke temperature, TtH i RevTaq.Ova dva enzima imaju i funkciju DNK polimeraze, pa se nazivaju bifunkcionalnim enzimima.

TtH DNK polimeraza

Sigurno ste čuli za TtH, koji je izveden iz termofilne bakterije Thermus thermophilus HB8.U prisustvu dvovalentnih katjona kao što je Mg2+, ima aktivnost DNK polimeraze.Široko se koristi u PCR reakcijama kao što je Taq enzim, ali ima veću otpornost na toplinu od Taq enzima, tako da također ima bolji učinak na PCR sa šablonima s visokim sadržajem GC.

· Ovaj enzim u osnovi nema 3′→5′ egzonukleaznu aktivnost i 5′→3′ egzonukleaznu aktivnost, tako da se može koristiti i za dideoksi sekvenciranje.

· Ovaj enzim ima aktivnost RTase.U prisustvu Mn2+, aktivnost RTase će biti pojačana.Koristeći ovu funkciju, može se koristiti za izvođenje reakcije reverzne transkripcije i PCR reakcije u istoj epruveti, odnosno RT-PCR u jednom koraku.Međutim, u prisustvu Mn2+, tačnost RT-PCR nije visoka.RT aktivnost nema nikakve veze sa aktivnošću RNAaze H.

· Povećana aktivnost Tth-DNK polimeraze (pH9, optimalno +55℃～+70℃, maksimalno +95℃) prevazilazi probleme uzrokovane sekundarnom strukturom RNK.Rezultirajuća cDNK se može amplificirati PCR-om sa istim enzimom u prisustvu Mg2+ jona.

· Sposobnost Tth-DNA polimeraze da izvrši reverznu transkripciju i amplifikaciju DNK na visokim temperaturama čini ovaj enzim korisnim za kvantitativnu RT-PCR, kloniranje i analizu genske ekspresije ćelijske i virusne RNK.
· Tth-DNK polimeraza se koristi za RT-PCR za amplifikaciju RNK do 1 kb.

Karakteristike i prednosti

Tth DNK polimeraza:

• Osigurajte optimiziranu veličinu proizvoda lančane reakcije polimeraze (PCR), najmanje 1000 bp u RT-PCR reakciji

• Prihvatite modifikovani deoksiribonukleozid trifosfat kao supstrat

• Nije povezano sa aktivnošću RNaze H

• Ima visoku termičku stabilnost za prevazilaženje problema, obično povezanih sa visokom sekundarnom strukturom prisutnom u RNK

RevTaq RT-PCR DNK polimeraza

DNK polimeraza otporna na toplinu s aktivnošću reverzne transkriptaze

RevTaq-RT-PCR-DNA polimeraza je konstruiran, visoko otporan na toplinu, dvostruko funkcionalan enzim s aktivnostima reverzne transkriptaze i DNK polimeraze dobivene usmjerenom i umjetnom evolucijom.

· Poluživot RevTaq RT-PCR DNK polimeraze na 95°C je duži od 40 minuta.

· RevTaq RT-PCR DNK polimeraza omogućava visokotemperaturnu reverznu transkripciju direktno iz RNA šablona, ​​a korak reverzne transkripcije može se ponoviti više puta kako bi se stvorilo više cDNK šablona.

· RevTaq RT-PCR DNK polimeraza omogućava RT-PCR „nulti korak” (bez izotermnog koraka reverzne transkripcije), jer se u cikličnom PCR produžetku, reverzna transkripcija i amplifikacija DNK odvijaju istovremeno.Ovo također potiče reakciju reverzne transkripcije na visokim temperaturama, čime se minimiziraju problemi koji se javljaju pri topljenju jake sekundarne strukture u RNK na visokim temperaturama.

· Zbog formule vrućeg starta zasnovane na aptameru, RevTaq RT-PCR DNK polimeraza će dati bolje rezultate kada je temperatura žarenja i ekstenzije viša od 57°C.

· Pošto je enzim otporan na toplotu, preporučuje se dizajniranje prajmera i sondi sa veoma visokim tačkama topljenja (>60°C).

· Preporučuje se optimizacija temperature koraka žarenja/produživanja kroz temperaturni gradijent tokom procesa postavljanja reakcije.

· Što je temperatura viša, to je veća specifičnost PCR-a.Ciklus reverzne transkripcije se obično izvodi na višoj temperaturi od PCR ciklusa, jer hibridizacija DNK Primer:RNA Template obično ima višu tačku topljenja od dupleksa DNK Primer:cDNA Template.

· RevTaq RT-PCR DNK polimeraza je genetski modifikovana i optimizovana, a veličina amplikona je između 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR granica detekcije DNK polimeraze dostiže 4 kopije/

Optimizovani reakcioni sistem (uspostavljanje prajmera visoke tačke topljenja) je prikazan na slici.RT-PCR vođen RevTaq RT-PCR DNK polimerazom pokazuje bolju osjetljivost od TaqPath 1-step RT-qPCR master mješavine i nižu detekciju gradijenta razrjeđenja uzorka.

Više prednosti:

Funkcija brzog pokretanja → Početni korak termičke denaturacije može se preskočiti.

Hot start aptamer formula → Odmah obezbedite 100% aktivnost enzima i sprečite nespecifično pojačanje na niskim temperaturama (<57°C).

Funkcija cijepanja → Korak ekstrakcije RNK je izostavljen, jer RevTaq RT-PCR DNK polimeraza također može obraditi uzorke sirove reakcije.Može odmah uništiti ćelijske membrane eukariota, bakterija i virusa u vrućem RT-PCR ciklusu.

IVD nivo sirovine → visoki standardi kvaliteta i izuzetno konkurentne cijene