Savjeti za poboljšanje obnavljanja ljepila

1. Povećajte opterećenje uzorka tokom elektroforeze.

2. Koristite svježe pripremljeni pufer za elektroforezu.

3. Kada sečete ljepilo, pokušajte rezati samo ljepilo trakama kako biste smanjili volumen rezanja ljepila: ne trebate ljepilo sa nekoliko namjenskih fragmenata, inače će utjecati na stopu oporavka.

4. Nakon što otopite dva ili više komada ljepila, upotrijebite tubu bez obzira koliki je volumen i prebacite je u istu kolonu.

5. Otopina dodana u sol može biti malo više, što je pogodnije za vezivanje DNK za membranu, ali općenito ne prelazi 750ul.

6. Ključ za oporavak gela je vezanje DNK za kolonu kroz koncentraciju soli, kiselost (naboj) i hidrofobnost otopine u koloni.Stoga, ako je pH pufera za elektroforezu previsok, 10ul (pH 5,0, 3mol/L NaAC) se može dodati u sol;da bi se bolje presreli DNK molekuli na membrani, može se dodati 30% izopropanola za zagrijavanje u tekućinu nakon rastvaranja ljepila.

7. Prije dodavanja eluensa, ostavite kolonu na sobnoj temperaturi nekoliko minuta (oko 10 minuta) da potpuno ispari etanol.

8. Na kraju, dodajte manje eluenta da biste smanjili zapreminu za oporavak.Generalno, za eluiranje se koristi 30-50μl eluenta (ne premalo, inače neće moći navlažiti membranu, što nije pogodno za eluiranje);eluacijske kapljice su u centru membrane, kako bi se u potpunosti eluirala DNK vezana za membranu.

9. Nakon dodavanja eluenta može se eluirati u vodenom kupatilu na 55 stepeni 5 minuta ili staviti u vodeno kupatilo na 50 stepeni duže od 10 minuta, ili zapečatiti parafilmom na 4 stepena preko noći, a zatim centrifugirati za oporavak sledećeg dana, efekat je dobar.

10. Dodajte centrifugirani eluat nazad u adsorpcionu kolonu i ponovo centrifugirajte.

Detaljne metode i procedure za obnavljanje PCR proizvoda

1. Obična reciklaža gume

Ako želite povratiti ljepilo, najbolje je koristiti komplet koji je zgodan i ima nešto veću stopu oporavka.Ako ga zaista trebate ručno oporaviti, možete dodati 3 puta veći volumen TE nakon rezanja ljepila.Nakon topljenja u vodenom kupatilu, fenol, fenol/hloroform se čisto ekstrahuju, a etanol se taloži.To je to.

2. Oporavak DNK iz gelova niske tačke topljenja

Prečišćavanje fragmenata DNK Dodajte TE (10 mmol/l Tris-HCl pH8,0, 0,1 mmol/l EDTA) jednak zapremini gela i stavite u vodeno kupatilo na 65°C na 5 minuta da se gel potpuno rastvori.

Nakon što je dovedena na sobnu temperaturu, dodana je jednaka količina fenola (zasićena TE, TE je zatvoren u gornji sloj, a donji sloj fenola je uklonjen) i smjesa je lagano promiješana (nije potrebno miješanje) i centrifugirana na 12.000 o/min 3 minute.Ponovite 1-2 puta.

Uzmite supernatant, dodajte 0,1 zapreminu 3mol/L natrijum acetata (pH 5,2) i 2,5 puta zapreminu apsolutnog etanola da biste izvršili precipitaciju etanolom.Otopite pročišćenu DNK odgovarajućom količinom TE, izmjerite sadržaj i pripremite za upotrebu (može se koristiti za analizu strukture ciljnog gena, pripremu sonde, itd.).

3. PCR oporavak sa dobrom specifičnošću amplifikacije

Ako je specifičnost PCR amplifikacije dobra, to je samo jednostavno pročišćavanje i obnavljanje PCR proizvoda.Možete dodati 50 ug/ml proteinaze K u PCR proizvod, 37 stepeni tokom 1 h, jednom ekstrahovati fenolom/hloroformom, jednom ekstrahovati hloroformom i dodati 0,1 zapreminu supernatanta.Natrijum acetat je rekuperiran precipitacijom sa 2,5 zapremine apsolutnog etanola.

Srodni proizvodi:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/