Nedavno sam otkrio nešto neverovatno!Mnogi napredni profesionalci za eksperimente oko njega ne znaju čak ni neke osnovne eksperimentalne tačke znanja.

Na primjer, možete li odgovoriti na sljedeća pitanja?

Postoji li razlika između OD260 i A260?Šta svaki znači?
OD je skraćenica od optičke gustoće (optička gustina), A je skraćenica od apsorpcije (apsorbancije), dva koncepta su zapravo ista, „optička gustina“ je „apsorbancija“, ali „optička gustina“ je u skladu sa većinom nacionalnih standarda i više je standardizovana.

Obično mjerimo OD vrijednost na 260nm da bismo izračunali koncentraciju nukleinske kiseline, pa šta predstavlja 1OD?
Nukleinska kiselina ima maksimum apsorpcije na talasnoj dužini od 260nm, koja sadrži i DNK i RNK, kao i fragmentirane fragmente nukleinske kiseline (ovo je ključna tačka).
Vrijednost OD mjerena na talasnoj dužini od 260 nm zabilježena je kao OD260.Ako je uzorak čist, vrijednost OD260 može izračunati koncentraciju uzorka nukleinske kiseline.
1 OD260=50 μg/ml dsDNK (dvolančana DNK)
=37 μg/ml ssDNK (jednolančana DNK)
=40 μg/ml RNK
=30 μg/ml dNTPs (oligonukleotidi)
Postoji li ikakva veza i razlika između RT-PCR, Realtime-PCR i QPCR?
RT-PCR je skraćenica za PCR sa reverznom transkripcijom
PCR u realnom vremenu=qPCR, skraćenica za kvantitativni PCR u realnom vremenu
Iako se čini da su PCR u realnom vremenu (fluorescentni kvantitativni PCR u realnom vremenu) i PCR s reverznom transkripcijom (reverzna transkripcija PCR) skraćeno kao RT-PCR.Ali međunarodna konvencija glasi: RT-PCR se posebno odnosi na PCR sa reverznom transkripcijom.

Koji su najčešće korišteni nt, bp i kb za opisivanje dužine DNK/RNA u biologiji?
nt = nukleotid
bp = bazni par bazni par
kb = kilobaza

Naravno, rekli biste da mnogi ljudi ne mare za ove sitne detalje!Svi to rade i niko vas neće pitati šta je to.Znate da je ovo nepotrebno, zar ne?

Ne, ne, ne, to je veoma potrebno znati!zbog čega?
Zato što želite da objavite članak!brate!Bilo da ciljate na diplomiranje ili na naučnoistraživačka dostignuća, morate se osloniti na članke da biste govorili!

Ekstrakcija nukleinske kiseline trebala bi biti najjednostavniji i najosnovniji eksperiment.Kvaliteta ekstrakcije nukleinske kiseline direktno određuje rezultate naknadnih eksperimenata.

Iako sam to rekao mnogo puta, još uvijek ima mnogo prijatelja kojima nije stalo.Ovaj put sam odlučio da se pomaknem iz članka!

Minimalne informacije za objavljivanje kvantitativnih PCR eksperimenata u realnom vremenu, koji se nazivaju MIQE, je skup smjernica za kvantitativne eksperimente fluorescencije objavljenih na međunarodnom nivou, koji predlažu minimalne standarde za eksperimentalne informacije potrebne za procjenu fluorescentnih kvantitativnih PCR eksperimenata i objavljivanje članaka.Kroz eksperimentalne uslove i metode analize koje je obezbedio eksperimentator, recenzenti mogu bolje proceniti validnost eksperimentalne šeme istraživača.

Može se vidjeti da su u dijelu ekstrakcije nukleinske kiseline predložene sljedeće detekcije,

“E” označava informacije koje se moraju dostaviti, a “D” označava informacije koje treba dati ako je potrebno.

Forma je veoma komplikovana, u stvari, želim da kažem da svi treba da počnu

čistoća (D), prinos (D), integritet (E) i konzistencija (E) za procjenu nukleinskih kiselina u ova četiri aspekta.

Prema eksperimentalnim navikama, prvo razgovarajte o metodama procjene čistoće i koncentracije.

Mjerenje OD je omiljena i najlakša metoda detekcije za eksperimentatore.Što se tiče principa, ovdje neću ulaziti u detalje.Mnoge laboratorije sada koriste ultra-mikro spektrofotometre za direktnu kvantitativnu analizu uzoraka nukleinskih kiselina.Dok prikazuje vrijednost apsorpcije, program direktno daje vrijednost koncentracije (nukleinske kiseline, proteina i fluorescentne boje) i povezane omjere.Što se tiče analize OD vrijednosti, sačuvajte ovu sliku i bit ćete dobro.

Lista rješenja univerzalne vrijednosti OD

Međutim, postoji nekoliko upozorenja koje morate izdvojiti za vas.

(Uostalom, znam da ste vi ti koji štede i čekaju dok vam zatrebaju!)

Napomena 1 Oprema

Na vrijednost OD će utjecati različita oprema.Sve dok je OD260 unutar određenog raspona, vrijednosti OD230 i OD280 su značajne.Na primjer, raspon apsorpcije uobičajenog Eppendorf D30 na 260nm je 0~3A, a NanoDrop One od Thermo je na 260nm.Opseg apsorpcije od 0,5~62,5A.

Napomena 2Reagens za razrjeđivanje

Na vrijednost OD može utjecati razrjeđivanje različitih reagenasa.Na primjer, očitavanje OD260/280 pročišćene RNK u pH7,5 10mM Trisbafer je između 1,9-2,1, dok je inneutralni vodeni rastvoromjer će biti manji, možda samo 1,8-2,0, ali to ne znači da se kvalitet RNK mijenja.

Napomena 3Preostale supstance

Postojanje rezidualnih supstanci uticaće na tačnost merenja koncentracije nukleinske kiseline, pa je neophodno što je moguće više izbegavati ostatke proteina, fenola, polisaharida i polifenola u uzorcima nukleinskih kiselina.

Međutim, u stvari, ekstrakcija organskim reagensima je stara metoda.U komercijalnim setovima, efekat ekstrakcije se može postići kroz adsorpcionu kolonu na bazi silicijum dioksida u kombinaciji sa centrifugiranjem, izbegavajući toksične i štetne organske reagense koje je teško ukloniti, itd. Problem, kao što je npr.Foregeneov komplet za ekstrakciju nukleinske kiseline, ne koristi DNazu/RNazu i toksične organske reagense tokom operacije, brzo i sigurno, iefekat jedobro(slučajno je rekao da je ćelav, ali znam da želiš znati).

Primjer 1: Prinos i čistoća ekstrakcije genomske DNK

Foregene Soil DNK komplet za izolaciju (DE-05511) tretira uzorke tla iz različitih izvora, a količina i čistoća dobijene genomske DNK prikazani su u sljedećoj tabeli:
Primjer 2: Prinos i čistoća ekstrakcije RNK tkiva

Komplet za izolaciju ukupne RNK životinja (RE-03012) obradio je različite uzorke tkiva, a količina i čistoća dobijene RNK prikazani su u donjoj tabeli (za tkivo miša):
Međutim, nemojte misliti da ste završili s vrijednošću OD.Da li se brineš o ključnim tačkama koje sam ti nacrtao ispred?

Biljeska

Fragmentirani molekuli nukleinske kiseline također će biti izračunati u apsorbanciji.Pod pretpostavkom da imate ostatke genomske DNK u RNK, vaša OD vrijednost će izgledati vrlo visoka, ali stvarna koncentracija RNK se ne može odrediti.Da li je vaša RNK Nije jasno da li postoji degradacija, tako da nam je i dalje potrebna sveobuhvatna metoda evaluacije da bismo dali precizniji sud, odnosno procjenu integriteta nukleinske kiseline spomenutu u MIQE.