1. Osnovno znanje (ako želite vidjeti eksperimentalni dio, prenesite direktno u drugi dio)
Kao derivativna reakcija konvencionalnog PCR-a, PCR u realnom vremenu uglavnom prati promjenu količine proizvoda amplifikacije u svakom ciklusu reakcije PCR amplifikacije u realnom vremenu kroz promjenu signala fluorescencije, i kvantitativno analizira početni šablon kroz odnos između ct vrijednosti i standardne krive.
Specifični podaci RT-PCR suosnovna linija, prag fluorescencijeiCt vrijednost.
| osnovna linija: | Vrijednost fluorescencije 3.-15. ciklusa je osnovna (bazna linija), koja je uzrokovana povremenom greškom mjerenja. |
| Prag (prag): | Odnosi se na granicu detekcije fluorescencije postavljenu na odgovarajuću poziciju u području eksponencijalnog rasta krivulje amplifikacije, općenito 10 puta veću od standardne devijacije osnovne linije. |
| CT vrijednost: | To je broj PCR ciklusa kada vrijednost fluorescencije u svakoj reakcijskoj epruveti dostigne prag. Vrijednost Ct je obrnuto proporcionalna količini početnog šablona. |
Uobičajene metode označavanja za RT-PCR:
| metoda | prednost | nedostatak | opseg primjene |
| SYBR GreenⅠ | Široka primjena, osjetljiva, jeftina i praktična | Zahtevi za prajmer su visoki, skloni su nespecifičnim trakama | Pogodan je za kvantitativnu analizu različitih ciljnih gena, istraživanja ekspresije gena i istraživanja na transgenim rekombinantnim životinjama i biljkama. |
| TaqMan | Dobra specifičnost i visoka ponovljivost | Cijena je visoka i pogodna samo za određene ciljeve. | Detekcija patogena, istraživanje gena rezistencije na lijekove, procjena efikasnosti lijekova, dijagnoza genetskih bolesti. |
| molekularni beacon | Visoka specifičnost, fluorescencija, niska pozadina | Cijena je visoka, samo za određenu namjenu, dizajn je težak, a cijena visoka. | Specifična genska analiza, SNP analiza |
2. Eksperimentalni koraci
2.1 O eksperimentalnom grupisanju- u grupi mora biti više bunara i mora postojati biološka ponavljanja.
| ① | Prazna kontrola | Koristi se za otkrivanje statusa rasta ćelija u eksperimentima |
| ② | Negativna kontrola siRNA (nespecifična siRNA sekvenca) | Pokažite specifičnost djelovanja RNAi.siRNA može izazvati nespecifičan odgovor na stres u koncentraciji od 200 nM. |
| ③ | Kontrola transfekcijskih reagensa | Isključiti toksičnost reagensa za transfekciju na stanice ili učinak na ekspresiju ciljnog gena |
| ④ | siRNA protiv ciljnog gena | Smanjite ekspresiju ciljnog gena |
| ⑤ (opcionalno) | pozitivna siRNA | Koristi se za rješavanje problema eksperimentalnog sistema i operativnih problema |
| ⑥ (opcionalno) | Fluorescentna kontrola siRNA | Efikasnost transfekcije ćelija može se posmatrati pod mikroskopom |
2.2 Principi dizajna prajmera
| Povećana veličina fragmenta | Po mogućnosti na 100-150bp |
| Dužina prajmera | 18-25bp |
| GC sadržaj | 30%-70%, poželjno 45%-55% |
| Tm vrijednost | 58-60℃ |
| Sequence | Izbjegavajte T/C kontinuirano;A/G kontinuirano |
| 3 kraj sekvence | Izbjegavajte GC bogate ili AT bogate;terminalna baza je poželjno G ili C;najbolje je izbjegavati T |
| Komplementarnost | Izbjegavajte komplementarne sekvence od više od 3 baze unutar prajmera ili između dva prajmera |
| Specifičnost | Koristite blast pretragu da potvrdite specifičnost prajmera |
①SiRNA je specifična za vrstu, a sekvence različitih vrsta će biti različite.
②SiRNA je upakovana u prah osušen zamrzavanjem, koji se može stabilno čuvati 2-4 nedelje na sobnoj temperaturi.
2.3 Alati ili reagensi koje treba pripremiti unaprijed
| Primer (interna referenca) | Uključujući dva naprijed i nazad |
| Prajmeri (ciljani gen) | Uključujući dva naprijed i nazad |
| Ciljana Si RNA (3 trake) | Generalno, kompanija će sintetizirati 3 trake, a zatim odabrati jednu od tri pomoću RT-PCR-a |
| Transfection Kit | Lipo2000 itd. |
| Komplet za brzu ekstrakciju RNA | Za ekstrakciju RNK nakon transfekcije |
| Komplet za brzu obrnutu transkripciju | za sintezu cDNK |
| PCR Amplification Kit | 2×Super SYBR zelena qPCR Master Mix |
2.4 Što se tiče pitanja na koja treba obratiti pažnju u konkretnim eksperimentalnim koracima:
①siRNA proces transfekcije
1. Za postavljanje, možete odabrati ploču s 24 jažica, ploču sa 12 jažica ili ploču sa 6 jažica (prosječna koncentracija RNK predložena u svakoj jažici ploče s 24 jažica je oko 100-300 ng/uL), a optimalna gustina transfekcije stanica je do 60 %-80% ili tako
2. Koraci transfekcije i specifični zahtjevi su striktno u skladu sa uputstvima.
3. Nakon transfekcije, uzorci se mogu prikupiti u roku od 24-72 sata za detekciju mRNA (RT-PCR) ili detekciju proteina u roku od 48-96 sati (WB)
② Proces ekstrakcije RNK
1. Spriječite kontaminaciju egzogenim enzimima.To uglavnom uključuje striktno nošenje maski i rukavica;korištenjem steriliziranih vrhova pipeta i EP epruveta;voda korištena u eksperimentu mora biti bez RNase.
2. Preporučljivo je učiniti dva puta kako je predloženo u kompletu za brzu ekstrakciju, što će zaista poboljšati čistoću i prinos.
3. Otpadna tečnost ne smije dodirivati RNK kolonu.
③ Kvantifikacija RNK
Nakon što je RNK ekstrahirana, može se kvantificirati direktno pomoću Nanodrop-a, a minimalno očitavanje može biti čak 10 ng/ul.
④ Proces obrnute transkripcije
1. Zbog visoke osjetljivosti RT-qPCR, potrebno je napraviti najmanje 3 paralelne jažice za svaki uzorak kako bi se spriječilo da naknadni Ct bude previše različit ili da SD bude prevelik za statističku analizu.
2. Nemojte više puta zamrzavati i odmrzavati Master mix.
3. Svaka cijev/rupa mora biti zamijenjena novim vrhom!Nemojte stalno koristiti isti vrh pipete za dodavanje uzoraka!
4. Film pričvršćen na ploču sa 96 jažica nakon dodavanja uzorka treba zagladiti pločom.Najbolje je centrifugirati prije nego što ga stavite na mašinu, kako bi tekućina na stijenci cijevi mogla teći dolje i ukloniti mjehuriće zraka.
⑤Uobičajena analiza krive
| Nema perioda logaritamskog rasta | Moguća visoka koncentracija šablona |
| Nema CT vrednosti | Nepravilni koraci za detekciju fluorescentnih signala; degradacija prajmera ili sondi – njihov integritet se može otkriti PAGE elektroforezom; nedovoljna količina šablona; degradacija šablona – izbjegavanje unošenja nečistoća i ponovnog zamrzavanja i odmrzavanja u pripremi uzorka; |
| Ct>38 | Niska efikasnost pojačanja;PCR proizvod je predugačak;razne komponente reakcije se razgrađuju |
| Linearna kriva pojačanja | Sonde se mogu djelomično degradirati ponovljenim ciklusima zamrzavanja-odmrzavanja ili produženim izlaganjem svjetlu |
| Razlika u duplim rupama je posebno velika | Reakciona otopina nije potpuno otopljena ili reakcijska otopina nije pomiješana;termalna kupka PCR instrumenta je kontaminirana fluorescentnim supstancama |
2.5 O analizi podataka
Analiza podataka qPCR-a može se podijeliti na relativnu kvantifikaciju i apsolutnu kvantifikaciju.Na primjer, ćelije u tretiranoj grupi u poređenju sa ćelijama u kontrolnoj grupi,
Koliko se puta mijenja mRNA gena X, ovo je relativna kvantifikacija;u određenom broju ćelija, mRNA gena X
Koliko kopija ima, ovo je apsolutna kvantifikacija.Obično ono što najviše koristimo u laboratoriji je relativna kvantitativna metoda.obično,2-ΔΔct metodase najviše koristi u eksperimentima, tako da će samo ova metoda biti detaljno predstavljena ovdje.
2-ΔΔct metoda: Dobiveni rezultat je razlika u ekspresiji ciljnog gena u eksperimentalnoj grupi u odnosu na ciljni gen u kontrolnoj grupi.Potrebno je da efikasnost amplifikacije i ciljnog gena i internog referentnog gena bude blizu 100%, a relativno odstupanje ne bi trebalo da prelazi 5%.
Metoda obračuna je sljedeća:
Δct kontrolna grupa = ct vrijednost ciljnog gena u kontrolnoj grupi – ct vrijednost internog referentnog gena u kontrolnoj grupi
Δct eksperimentalna grupa = ct vrijednost ciljnog gena u eksperimentalnoj grupi – ct vrijednost internog referentnog gena u eksperimentalnoj grupi
ΔΔct=Δct eksperimentalna grupa-Δct kontrolna grupa
Konačno, izračunajte višekratnik razlike u nivou izraza:
Promjena Fold=2-ΔΔct (odgovara funkciji excel je POWER)
Srodni proizvodi:
Vrijeme objave: 20.05.2023
