Ⅰ. Povećajte osjetljivost reakcionog sistema:

1. Odvojite RNK visokog kvaliteta:

Uspješna sinteza cDNK dolazi od visokokvalitetne RNK.Visokokvalitetna RNK bi trebala osigurati barem ukupno duže i ne sadrži inhibitore koji ne sadrže enzime za snimanje, kao što su EDTA ili SDS.Kvalitet RNK određuje maksimalnu vrijednost informacija o sekvenci koju možete prepisati u cDNK.Opća metoda pročišćavanja RNK je korak metoda korištenja izoocijanata/acidofenola.Kako bi se spriječilo zagađenje RNase, RNK odvojena od uzorka bogatog RNKazom (kao što je gušterača) zahtijeva skladištenje formaldehida kako bi se sačuvala visokokvalitetna RNK, što je još važnije za dugotrajno skladištenje.RNK ekstrahirana iz jetre pacova se u osnovi razgradila nakon jedne sedmice čuvanja u vodi, dok je RNK ekstrahirana iz slezene pacova ostala stabilna nakon tri godine skladištenja u vodi.Osim toga, transkripti veći od 4 kb osjetljiviji su na degradaciju RNase u tragovima od malih transkripata.Kako bi se povećala stabilnost skladišnog uzorka RNK, RNK se može otopiti u metalmaminu iona i čuva se na -70 °C.Tilid koji se koristi za čuvanje RNK ne smije sadržavati razne objekte koji razgrađuju RNK.RNK, koja je izvedena iz pankreasa, može se čuvati u metalmaminu najmanje godinu dana.Kada ste spremni za korištenje RNK, možete koristiti sljedeće metode za taloženje RNK: dodajte NaCl u 0,2m i 4 puta veću zapreminu etanola, stavite na sobnu temperaturu 3-5 minuta i 10.000 × g centrifugirajte 5 minuta.

2. Koristite reverznu transkriptazu bez aktivnosti RNaseH (RNaseH-):

Inhibitori RNaze se često dodaju reakcijama reverzne transkripcije kako bi se povećala dužina i prinos cDNK sinteze.Inhibitor RNaze se dodaje u prvoj reakciji lančane sinteze u prisustvu pufera i redukcijskih agenasa kao što je DTT jer proces sinteze pre-cDNA denaturira inhibitor, čime se oslobađaju vezane RNKaze koje razgrađuju RNK.Inhibitor proteinske RNaze samo sprečava razgradnju RNK od strane RNKaze A, B, C i ne sprečava RNaze na koži, tako da treba paziti da se RNaze ne unose iz prstiju uprkos upotrebi ovih inhibitora.

Reverzna transkriptaza katalizira konverziju RNK u cDNK.I M-MLV i AMV imaju endogenu RNaseH aktivnost pored sopstvene aktivnosti polimeraze.Aktivnost RNaseH se nadmeće sa aktivnošću polimeraze za heterozigotne lančiće formirane između RNA šablona i DNK prajmera ili cDNK produžetka lanaca, i razgrađuje RNA: RNA lance u DNK kompleksima.RNK šabloni degradirani aktivnošću RNaseH ne mogu se više koristiti kao efikasni supstrati za sintezu cDNK, smanjujući prinos i dužinu sinteze cDNK.Stoga bi eliminacija ili značajno smanjenje RNaseH aktivnosti reverzne transkriptaze bilo od velike koristi.

SuperScriptⅡ reverzna transkriptaza, MMLV reverzna transkriptaza RNaseH- i thermoScript reverzna transkriptaza, AMV od RNaseH- dale su više cDNK pune dužine nego MMLV i AMV.Na RT-PCR osjetljivost utiče količina sintetizirane cDNK.ThermoScript je mnogo osjetljiviji od AMV-a.Veličina RT-PCR proizvoda je ograničena sposobnošću reverzne transkriptaze da sintetiše cDNK, posebno kada se kloniraju veće Cdnas.U poređenju sa MMLV, SuperScripⅡ je značajno povećao prinos dugih RT-PCR proizvoda.Reverzna transkriptaza RNaseH-a takođe povećava termičku stabilnost, tako da se reakcija može izvesti na temperaturama višim od normalnih od 37-42℃.U predloženim uslovima sinteze korišćeni su oligo(dT) prajmeri i 10μCi [alpha-p]dCTP.Ukupna proizvodnja prvog lanca izračunata je metodom TCA precipitacije.cDNK pune dužine je analizirana korištenjem uklanjanja traka sortiranih po veličini i brojanja u alkalnom agaroznom gelu.

3. Povećajte temperaturu očuvanja topline reverzne transkripcije:

Viša temperatura zadržavanja pomaže da se otvori sekundarna struktura RNK i poveća prinos reakcije.Za većinu RNK šablona, ​​držanje RNK i prajmera na 65°C bez pufera ili soli, a zatim njihovo brzo hlađenje na ledu eliminiše većinu sekundarnih struktura i omogućava prajmerima da se vežu.Međutim, neki šabloni i dalje imaju sekundarnu strukturu, čak i nakon termičke denaturacije.Amplifikacija ovih teških šablona može se izvesti pomoću ThermoScript reverzne transkriptaze i postavljanjem reakcije reverzne transkriptaze na više temperature kako bi se poboljšala amplifikacija.Više temperature držanja takođe mogu povećati specifičnost, posebno kada se sinteza cDNK izvodi pomoću gen-specifičnih prajmera (GSPS) (vidi Poglavlje 3).Ako koristite GSP, uvjerite se da je vrijednost Tm prajmera ista kao i očekivana temperatura držanja.Nemojte koristiti oligo(dT) i nasumične prajmere iznad 60℃.Nasumični prajmeri treba da se drže na 25℃ 10 minuta pre nego što se poveća na 60℃.Uz korištenje viših temperatura reverzne transkripcije, specifičnost se može poboljšati direktnim prijenosom mješavine RNA/prajmera sa temperature denaturacije od 65℃ na temperaturu zadržavanja reverzne transkripcije i dodavanjem prethodno zagrijane 2× reakcijske smjese (cDNA termalna inicijalna sinteza).Ovaj pristup pomaže u sprečavanju intermolekularnog uparivanja baza koje se javlja na nižim temperaturama.Upotreba PCR instrumenta pojednostavljuje mnoge temperaturne prekidače potrebne za RT-PCR.

T-ta toplotno stabilizovana polimeraza deluje kao DNK polimeraza u prisustvu Mg2+ i RNK polimeraza u prisustvu Mn2+.Može zadržati toplotu do 65℃.Međutim, prisustvo Mn2+ tokom PCR-a smanjuje vjernost, što Tth polimerazu čini manje pogodnom za visoko preciznu amplifikaciju, kao što je kloniranje cDNK.Osim toga, Tth je manje efikasan u reverznoj transkripciji, što smanjuje osjetljivost, a budući da jedan enzim može izvršiti reverznu transkripciju i PCR, kontrolne reakcije bez reverzne transkripcije ne mogu se koristiti za razlikovanje amplificiranih proizvoda cDNK od onih kontaminirane genomske DNK.

4. Aditiv koji promoviše obrnutu transkripciju:

Dodavanje aditiva, uključujući glicerin i DMSO, u prvu reakciju lančane sinteze može smanjiti stabilnost dvostrukog lanca nukleinske kiseline i odmotati sekundarnu strukturu RNK.Može se dodati do 20% glicerina ili 10% DMSO bez uticaja na aktivnost SuperScriptⅡ ili MMLV.AMV takođe može tolerisati do 20% glicerola bez smanjenja aktivnosti.Da bi se maksimizirala osjetljivost RT-PCR u reakciji reverzne transkripcije SuperScriptⅡ, može se dodati 10% glicerola i izolirati na 45℃.Ako se 1/10 proizvoda reakcije retrotranskripcije doda u PCR, koncentracija glicerola u reakciji amplifikacije je 0,4%, što nije dovoljno da inhibira PCR.

5. RNaseH obrada:

Osetljivost se može poboljšati tretiranjem reakcija sinteze cDNK sa RNaseH pre PCR-a.Za neke šablone, smatra se da RNK u reakciji sinteze cDNA sprečava vezivanje amplificiranih proizvoda, u kom slučaju tretman RNaseH može povećati osjetljivost.Generalno, tretman RNaseH je potreban za amplifikaciju relativno dugog cDNK ciljnog šablona pune dužine, kao što je tuberozna scherozaⅡ sa niskom kopijom.Za ovaj težak šablon, RNaseH je poboljšao signal generisan od cDNK sintetizovane SuperScriptⅡ ili AMV.Za većinu RT-PCR reakcija, tretman RNaseH nije obavezan jer korak denaturacije PCR izolacijom od 95℃ tipično hidrolizira RNK iz kompleksa RNA:DNK.

6. Poboljšane metode za otkrivanje malih količina RNK:

RT-PCR je posebno izazovan kada su dostupne samo male količine RNK.Dodavanje glikogena kao nosača tokom odvajanja RNK pomaže da se poveća prinos malih uzoraka.Glikogen bez RNaze može se dodati istovremeno sa Trizolom.Glikogen je topiv u vodi i može ostati u vodenoj fazi s RNK kako bi pomogao u kasnijim precipitacijama.Preporučena koncentracija glikogena bez RNAze je 250 μg/ml za uzorke manje od 50 mg tkiva ili 106 kultiviranih ćelija.

Dodavanje acetiliranog BSA reakcijama reverzne transkripcije pomoću SuperScriptⅡ može povećati osjetljivost, a za male količine RNK smanjenje količine SuperScriptⅡ i dodavanje 40 jedinica inhibitora nukleaze RnaseOut može poboljšati nivo detekcije.Ako se glikogen koristi za odvajanje RNK, i dalje se preporučuje dodavanje inhibitora BSA ili RNKaze za reverziju transkripcionih reakcija pomoću SuperScriptⅡ.

Ⅱ. Povećajte specifičnost RT-PCR

1. cNDA sinteza:

Tri različite metode mogu se koristiti za pokretanje sinteze prvog lanca cDNK, a relativna specifičnost svake metode utječe na količinu i tip sintetizirane cDNK.

Metoda slučajnog prajmera je najmanje specifična od tri metode.Prajmeri se žare na više mjesta u cijelom transkriptu kako bi se proizvela kratka cDNK djelomične dužine.Ova metoda se često koristi za dobijanje 5′ terminalnih sekvenci i cDNK iz RNA šablona sa sekundarnim strukturnim regionima ili sa terminacionim mestima koja se reverzna transkriptaza ne može replicirati.Da bi se dobila najduža cDNK, omjer prajmera i RNK u svakom uzorku RNK treba empirijski odrediti.Početna koncentracija nasumičnih prajmera kreće se od 50 do 250 ng po reakcionom sistemu od 20 μl.Budući da je cDNK sintetizirana iz ukupne RNK korištenjem nasumičnih prajmera uglavnom ribosomalna RNA, poli(A)+RNA se općenito bira kao šablon.

Oligo(dT) inicijacija je specifičnija od nasumičnih prajmera.Hibridizira se s poli(A) repom koji se nalazi na 3′ kraju mRNA u većini eukariotskih ćelija.Budući da poli(A)+RNA čini otprilike 1% do 2% ukupne RNK, količina i složenost cDNK je mnogo manja nego kada bi se koristili nasumični prajmeri.Zbog svoje visoke specifičnosti, oligo(dT) općenito ne zahtijeva optimizaciju za omjer RNA prema prajmeru i poli(A)+ selekciju.Preporučuje se upotreba 0,5 μg oligo(dT) po 20 μl reakcijskog sistema.oligo(dT)12-18 je pogodan za većinu RT-PCR.ThermoScript RT-PCR sistem obezbeđuje oligo(dT)20 zbog svoje dobre termičke stabilnosti i pogodan je za više temperature držanja.

Gene-specifični prajmeri (GSP) su najbolji specifični prajmeri za korak reverzne transkripcije.GSP je antisens oligonukleozid koji se može specifično hibridizirati s RNA odredišnim sekvencama, umjesto da žari sve RNK poput nasumičnih prajmera ili oligo(dT).Pravila korištena za dizajniranje PCR prajmera također se primjenjuju na dizajn GSP reakcije reverzne transkripcije.GSP može biti ista sekvenca kao prajmer za amplifikaciju koji je žaren na kraju mRNA3′, ili GSP može biti dizajniran tako da se žari nizvodno sa prajmerom za reverznu amplifikaciju.Za neke amplificirane objekte, potrebno je dizajnirati više od jednog antisens prajmera za uspješan RT-PCR jer sekundarna struktura ciljne RNK može spriječiti vezivanje prajmera.Predlaže se upotreba 1pmol antisense GSP u prvom sistemu reakcije lančane sinteze od 20μl.

2. Povećajte temperaturu očuvanja topline reverzne transkripcije:

Da bi se u potpunosti iskoristila GSP specifičnost, treba koristiti reverznu transkriptazu visoke termičke stabilnosti.Reverzna transkriptaza stabilna na toplinu može se izolirati na višim temperaturama kako bi se povećala strogost reakcije.Na primjer, ako se GSP žari na 55°C, onda se specifičnost GSP-a ne koristi u potpunosti ako se reverzna transkripcija izvodi na 37°C sa niskom strogošću koristeći AMV ili M-MLV.Međutim, SuperScripⅡ i ThermoScript mogu reagovati na 50℃ ili više, što eliminiše nespecifične proizvode proizvedene na nižim temperaturama.Za maksimalnu specifičnost, mješavina RNA/prajmera može se prenijeti direktno sa temperature denaturacije od 65℃ na temperaturu zadržavanja reverzne transkripcije uz dodavanje prethodno zagrijane 2 x reakcione smjese (termičko pokretanje sinteze cDNK).Ovo pomaže u sprečavanju uparivanja baza između molekula na niskim temperaturama.Korišćenje PCR instrumenta pojednostavljuje mnoge temperaturne prelaze potrebne za RT-PCR.

3. Smanjite kontaminaciju genomske DNK:

Jedna potencijalna poteškoća sa RT-PCR-om je da RNK kontaminira genomsku DNK.Upotreba boljih metoda odvajanja RNK, kao što je Trizol reagens, smanjuje kontaminaciju genomske DNK u RNK preparatima.Da bi se izbjegli proizvodi proizvedeni iz genomske DNK, RNK se može tretirati DNAsⅠ stepena amplifikacije kako bi se uklonila kontaminirana DNK prije reverzne transkripcije.Uzorci su držani na 65℃ u 2,0 mM EDTA 10 minuta da bi se prekinula probava DNaseⅠ.EDTA helatira ione magnezija kako bi spriječio hidrolizu RNK zavisne od jona magnezija koja se javlja na visokim temperaturama.

Da bi se odvojila amplificirana cDNK od produkta amplifikacije genoma DNK, mogu se dizajnirati prajmeri koji se posebno žare sa odvojenim egzonom.PCR proizvodi izvedeni iz cDNK bit će kraći od onih dobivenih iz kontaminirane genomske DNK.Kontrolirani eksperiment bez reverzne transkripcije također se izvodi na svakom RNK šablonu kako bi se utvrdilo da li je dati fragment iz genomske DNK ili cDNK.PCR proizvodi dobiveni u odsustvu reverzne transkripcije su izvedeni iz genoma.

Povezani proizvod

RT-PCR Easy^ᵀᴹja (jedan korak)

-One-step kit omogućava da se reverzna transkripcija i PCR izvode u istoj epruveti.Potrebno je samo dodati šablonsku RNK, specifične PCR prajmere i ddH bez RNaze₂O.

- Kvantitativna analiza RNK u realnom vremenu može se izvršiti brzo i precizno.

-Kit koristi jedinstveni Foregene reagens reverzne transkripcije i Foregene HotStar Taq DNK polimerazu u kombinaciji sa jedinstvenim reakcionim sistemom za efikasno poboljšanje efikasnosti amplifikacije i specifičnosti reakcije.

-Optimizirani sistem reakcije čini da reakcija ima veću osjetljivost detekcije, veću termičku stabilnost i bolju toleranciju.

RT Easy II (sa GDNase) Master premiks za prvu lančanu CDNA sintezu za PCR u realnom vremenu sa GDNase

-Efikasna sposobnost uklanjanja gDNK, koja može ukloniti gDNK u šablonu u roku od 2 minute.

- Efikasan sistem reverzne transkripcije, potrebno je samo 15 minuta da se završi sinteza prvog lanca cDNK.

-Složeni šabloni: šabloni sa visokim sadržajem GC i složenom sekundarnom strukturom se takođe mogu obrnuti sa velikom efikasnošću.

- Visokoosjetljivi sistem reverzne transkripcije, šabloni na nivou pg također mogu dobiti visokokvalitetnu cDNK.

-Sistem obrnute transkripcije ima visoku termičku stabilnost, optimalna temperatura reakcije je 42℃, a i dalje ima dobre performanse reverzne transkripcije na 50℃.