一、Povećajte osjetljivost reakcionog sistema:

1. Izolirajte RNK visokog kvaliteta:

Uspješna sinteza cDNK dolazi od visokokvalitetne RNK.Visokokvalitetna RNK bi barem trebala biti pune dužine i bez inhibitora reverzne transkriptaze kao što su EDTA ili SDS.Kvalitet RNK određuje maksimalnu količinu informacija o sekvenci koju možete prepisati u cDNK.Uobičajena metoda pročišćavanja RNK je metoda u jednom koraku koristeći gvanidin izotiocijanat/kiseli fenol.Kako bi se spriječila kontaminacija količinama RNKaze u tragovima, RNK izolirana iz uzoraka bogatih RNazom (kao što je gušterača) treba biti pohranjena u formaldehidu kako bi se očuvala visokokvalitetna RNK, posebno za dugotrajno skladištenje.RNK ekstrahirana iz jetre pacova se u osnovi razgradila nakon što je bila pohranjena u vodi jednu sedmicu, dok je RNK ekstrahirana iz slezene pacova ostala stabilna nakon što je bila pohranjena u vodi 3 godine.Osim toga, transkripti duži od 4 kb osjetljiviji su na degradaciju RNazama u tragovima nego mali transkripti.Da bi se povećala stabilnost uskladištenih uzoraka RNK, RNK se može rastvoriti u dejonizovanom formamidu i čuvati na -70°C.Formamid koji se koristi za očuvanje RNK mora biti bez ostataka koji razgrađuju RNK.RNK iz pankreasa može se sačuvati u foramidu najmanje godinu dana.Kada se pripremate za upotrebu RNK, možete koristiti sljedeću metodu za taloženje RNK: dodajte NaCl u 0,2M i 4 puta veći volumen etanola, stavite na sobnu temperaturu 3-5 minuta i centrifugirajte na 10.000×g 5 minuta.

2. Koristite RNaseH-neaktivnu (RNaseH-) reverznu transkriptazu:

Inhibitori RNaze se često dodaju reakcijama reverzne transkripcije kako bi se povećala dužina i prinos cDNK sinteze.Inhibitore RNaze treba dodati tokom reakcije sinteze prvog lanca u prisustvu pufera i redukcionog agensa (kao što je DTT), jer proces prije sinteze cDNK denaturira inhibitor, čime se oslobađa vezana RNKaza koja može razgraditi RNK.Inhibitori proteinske RNaze samo sprečavaju razgradnju RNK od strane RNaze A, B, C, i ne sprečavaju RNazu na koži, stoga pazite da ne unesete RNKazu sa svojih prstiju uprkos upotrebi ovih inhibitora.

Reverzna transkriptaza katalizira konverziju RNK u cDNK.I M-MLV i AMV imaju endogenu RNaseH aktivnost pored sopstvene aktivnosti polimeraze.Aktivnost RNaseH i aktivnost polimeraze međusobno se nadmeću za hibridni lanac formiran između RNA šablona i DNK prajmera ili cDNK produžetka lanca, i razgrađuju RNA lanac u RNA:DNK kompleksu.RNK šablon degradiran aktivnošću RNaseH ne može više da služi kao efikasan supstrat za sintezu cDNK, što smanjuje prinos i dužinu sinteze cDNK.Stoga bi bilo korisno eliminirati ili uvelike smanjiti aktivnost RNaseH reverzne transkriptaze.。

SuperScript Ⅱ reverzna transkriptaza, RNaseH-MMLV reverzna transkriptaza i thermoScript reverzna transkriptaza, RNaseH-AMV, mogu dobiti veću količinu i više cDNK pune dužine nego MMLV i AMV.Na RT-PCR osjetljivost će utjecati količina sinteze cDNK.ThermoScript je mnogo osjetljiviji od AMV-a.Veličina RT-PCR proizvoda ograničena je sposobnošću reverzne transkriptaze da sintetiše cDNK, posebno kada se kloniraju veće cDNK.U poređenju sa MMLV, SuperScripⅡ je značajno povećao prinos dugih RT-PCR proizvoda.RNaseH-reverzna transkriptaza takođe ima povećanu termostabilnost, tako da se reakcija može izvesti na temperaturama višim od normalnih 37-42°C.Pod predloženim uslovima sinteze, koristite oligo(dT) prajmer i 10 μCi [α-P]dCTP.Ukupan prinos prvog lanca izračunat je primjenom TCA metode precipitacije.cDNK pune dužine je analizirana korištenjem veličinom sortiranih traka izrezanih i prebrojanih na alkalnom agaroznom gelu.

3. Povećajte temperaturu inkubacije za obrnutu transkripciju:

Viša temperatura inkubacije pomaže da se otvori sekundarna struktura RNK, povećavajući prinos reakcije.Za većinu RNK šablona, ​​inkubacija RNK i prajmera na 65°C bez pufera ili soli, praćena brzim hlađenjem na ledu će eliminisati većinu sekundarnih struktura i omogućiti prajmerima da se vežu.Međutim, neki šabloni i dalje imaju sekundarne strukture, čak i nakon toplotne denaturacije.Amplifikacija ovih teških šablona može se izvesti pomoću ThermoScript reverzne transkriptaze i postavljanja reakcije reverzne transkripcije na višu temperaturu kako bi se poboljšala amplifikacija.Više temperature inkubacije također mogu povećati specifičnost, posebno kada se za sintezu cDNK koriste genski specifični prajmeri (GSP) (vidi Poglavlje 3).Ako koristite GSP, osigurajte da je Tm prajmera isti kao i očekivana temperatura inkubacije.Nemojte koristiti oligo(dT) i nasumične prajmere iznad 60°C.Slučajni prajmeri zahtevaju inkubaciju na 25°C 10 minuta pre nego što se poveća na 60°C.Osim korištenja više temperature reverzne transkripcije, specifičnost se također može poboljšati direktnim prijenosom mješavine RNA/prajmera sa temperature denaturacije od 65°C na temperaturu inkubacije reverzne transkripcije i dodavanjem prethodno zagrijane 2× reakcijske smjese (cDNA hot-start synthesis).Ovaj pristup pomaže u sprečavanju intermolekularnog uparivanja baza koje se javlja na nižim temperaturama.Višestruko prebacivanje temperature potrebno za RT-PCR može se pojednostaviti korištenjem termalnog ciklusa.

T-ta termostabilna polimeraza djeluje kao DNK polimeraza u prisustvu Mg2+ i kao RNA polimeraza u prisustvu Mn2+.Može se održavati toplim na maksimalnoj temperaturi od 65°C.Međutim, prisustvo Mn2+ tokom PCR-a smanjuje vjernost, što čini Tth polimerazu manje pogodnom za visoko preciznu amplifikaciju, kao što je kloniranje cDNK.Osim toga, Tth ima nisku efikasnost reverzne transkripcije, što smanjuje osjetljivost, a budući da se reverzna transkripcija i PCR mogu izvesti s jednim enzimom, kontrolne reakcije bez reverzne transkripcije ne mogu se koristiti za poređenje proizvoda amplifikacije cDNK sa kontaminirajućom genomskom DNK.Proizvodi amplifikacije su odvojeni.

4. Aditivi koji promoviraju obrnutu transkripciju:

Aditivi uključujući glicerol i DMSO dodaju se reakciji sinteze prvog lanca, što može smanjiti stabilnost dvolančanog nukleinske kiseline i odvojiti sekundarnu strukturu RNK.Može se dodati do 20% glicerola ili 10% DMSO bez uticaja na aktivnost SuperScript II ili MMLV.AMV takođe može tolerisati do 20% glicerola bez gubitka aktivnosti.Da bi se maksimizirala osjetljivost RT-PCR u reakciji reverzne transkripcije SuperScriptⅡ, 10% glicerola se može dodati i inkubirati na 45°C.Ako se 1/10 proizvoda reakcije reverzne transkripcije doda u PCR, tada je koncentracija glicerola u reakciji amplifikacije 0,4%, što nije dovoljno za inhibiciju PCR.

5. RNaseH tretman:

Tretman reakcija sinteze cDNA sa RNaseH prije PCR-a može povećati osjetljivost.Za neke šablone, smatra se da RNK u reakciji sinteze cDNK sprečava vezivanje produkata amplifikacije, u kom slučaju tretman RNaseH može povećati osjetljivost.Generalno, tretman RNaseH je neophodan kada se pojačavaju duži cDNK ciljni šabloni pune dužine, kao što je tuberozna scheroza II sa niskim brojem kopija.Za ovaj teški šablon, tretman RNaseH je poboljšao signal proizveden od strane SuperScript II ili AMV-sintetizirane cDNK.Za većinu RT-PCR reakcija, tretman RNaseH je neobavezan, jer korak PCR denaturacije na 95°C općenito hidrolizira RNK u kompleksu RNA:DNK.

6. Poboljšanje metode detekcije male RNK:

RT-PCR je posebno izazovan kada su dostupne samo male količine RNK.Glikogen dodan kao nosač tokom izolacije RNK pomaže da se poveća prinos malih uzoraka.Glikogen bez RNaze može se dodati istovremeno sa dodatkom Trizola.Glikogen je rastvorljiv u vodi i može se držati u vodenoj fazi sa RNK da bi se potpomagalo kasnije taloženje.Za uzorke manje od 50 mg tkiva ili 106 kultiviranih ćelija, preporučena koncentracija glikogena bez RNaze je 250 μg/ml.

Dodavanje acetiliranog BSA u reakciju reverzne transkripcije pomoću SuperScript II može povećati osjetljivost, a za male količine RNK, smanjenje količine SuperScript II i dodavanje 40 jedinica RNaseOut inhibitora nukleaze može povećati nivo detekcije.Ako se glikogen koristi u procesu izolacije RNK, i dalje se preporučuje dodavanje BSA ili inhibitora RNKaze kada se koristi SuperScript II za reakciju reverzne transkripcije.

二、Povećanje RT-PCR specifičnosti

1. CND Asinteza:

Sinteza cDNK prvog lanca može se pokrenuti korištenjem tri različite metode, čija relativna specifičnost utječe na količinu i tip sintetizirane cDNK.

Metoda slučajnog prajmera bila je najmanje specifična od tri metode.Prajmeri se žare na više mjesta u transkriptu, stvarajući kratke cDNK djelomične dužine.Ova metoda se često koristi za dobijanje 5′ krajnjih sekvenci i za dobijanje cDNK iz RNA šablona sa regionima sekundarne strukture ili sa terminacionim mestima koja se ne mogu replicirati reverznom transkriptazom.Da bi se dobila najduža cDNK, omjer prajmera i RNK u svakom uzorku RNK treba empirijski odrediti.Početna koncentracija nasumičnih prajmera kretala se od 50 do 250 ng po reakciji od 20 μl.Budući da je cDNK sintetizirana iz ukupne RNK korištenjem nasumičnih prajmera prvenstveno ribosomalna RNA, poli(A)+RNA se općenito bira kao šablon.

Oligo(dT) prajmeri su specifičniji od nasumičnih prajmera.Hibridizira se sa poli(A) repom koji se nalazi na 3′ kraju većine eukariotskih mRNA.Budući da poli(A)+ RNA čini otprilike 1% do 2% ukupne RNK, količina i složenost cDNK je mnogo manja nego kod nasumičnih prajmera.Zbog svoje visoke specifičnosti, oligo(dT) općenito ne zahtijeva optimizaciju omjera RNK i prajmera i poli(A)+ selekciju.Preporučuje se upotreba 0,5 μg oligo(dT) po 20 μl reakcijskog sistema.oligo(dT)12-18 je pogodan za većinu RT-PCR.ThermoScript RT-PCR sistem nudi oligo(dT)20 zbog svoje bolje termičke stabilnosti za više temperature inkubacije.

Genski specifični prajmeri (GSP) su najspecifičniji prajmeri za korak reverzne transkripcije.GSP je antisens oligonukleotid koji se može specifično hibridizirati sa RNA ciljnom sekvencom, za razliku od nasumičnih prajmera ili oligo(dT), koji se spajaju sa svim RNK.Ista pravila koja se koriste za dizajniranje PCR prajmera važe za dizajn GSP u reakcijama reverzne transkripcije.GSP može biti ista sekvenca kao prajmer za amplifikaciju koji se spaja na krajnji kraj 3′ mRNA, ili GSP može biti dizajniran za žarenje nizvodno od prajmera reverzne amplifikacije.Za neke amplificirane subjekte potrebno je dizajnirati više od jednog antisens prajmera za uspješan RT-PCR jer sekundarna struktura ciljne RNK može spriječiti vezivanje prajmera.Preporučuje se upotreba 1 pmol antisense GSP u reakciji sinteze prvog lanca od 20 μl.

2. Podignite temperaturu inkubacije za obrnutu transkripciju:

Da bi se u potpunosti iskoristile sve prednosti GSP specifičnosti, trebalo bi koristiti reverznu transkriptazu sa većom termostabilnošću.Termostabilne reverzne transkriptaze mogu se inkubirati na višim temperaturama kako bi se povećala strogost reakcije.Na primjer, ako se GSP žari na 55°C, specifičnost GSP-a neće biti u potpunosti iskorištena ako se AMV ili M-MLV koristi za reverznu transkripciju pri niskoj strogosti od 37°C.Međutim, SuperScript II i ThermoScript mogu reagirati na 50°C ili više, što će eliminirati nespecifične proizvode koji nastaju na nižim temperaturama.Za maksimalnu specifičnost, mješavina RNA/prajmera može se prenijeti direktno sa temperature denaturacije od 65°C na temperaturu inkubacije reverzne transkripcije i dodati u prethodno zagrijanu 2× reakcijsku mješavinu (vrući početak sinteze cDNA).Ovo pomaže u sprečavanju intermolekularnog uparivanja baza na niskim temperaturama.Višestruki temperaturni prijelazi potrebni za RT-PCR mogu se pojednostaviti korištenjem termalnog ciklusa.

3. Smanjuje kontaminaciju genomske DNK:

Potencijalna poteškoća s kojom se susreće RT-PCR je kontaminacija genomske DNK u RNK.Korištenje dobre metode izolacije RNK, kao što je Trizol reagens, smanjit će količinu genomske DNK koja kontaminira RNA preparat.Da bi se izbjegli proizvodi izvedeni iz genomske DNK, RNK se može tretirati sa DNazom I stepena amplifikacije kako bi se uklonila kontaminirajuća DNK prije reverzne transkripcije.Digestija DNaze I je prekinuta inkubacijom uzoraka u 2,0 mM EDTA tokom 10 minuta na 65°C.EDTA može helirati jone magnezija, sprječavajući hidrolizu RNK zavisne od jona magnezija na visokim temperaturama.

Da bi se odvojila amplificirana cDNK od kontaminirajućih proizvoda amplifikacije genomske DNK, prajmeri se mogu dizajnirati tako da svaki žari za odvojene egzone.PCR proizvodi izvedeni iz cDNK bit će kraći od onih dobivenih iz kontaminirane genomske DNK.Dodatno, kontrolni eksperiment bez reverzne transkripcije izveden je na svakom RNK šablonu kako bi se utvrdilo da li je dati fragment izveden iz genomske DNK ili cDNK.PCR proizvod dobiven bez reverzne transkripcije je izveden iz genoma.