Kao nova u laboratoriji, nije dobar posao izdvojiti pozitivne biljke iz gomile biljaka s niskom stopom konverzije.Prvo, DNK se mora izdvojiti iz velikog broja uzoraka jedan po jedan, a zatim će se strani geni otkriti PCR-om.Međutim, rezultati su često praznine i trake s nekoliko stavki povremeno, ali je nemoguće utvrditi da li postoje propuštene detekcije ili lažne detekcije..Je li vrlo bespomoćno suočiti se s takvim eksperimentalnim procesom i rezultatima?Ne brini, brat te uči kako lako i precizno izdvojiti transgene pozitivne biljke.

Korak 1

Dizajn prajmera za detekciju

Odredite endogeni gen i egzogeni gen koji će se otkriti prema uzorku koji se testira i odaberite reprezentativnu sekvencu od 100-500 bp u genu za dizajn prajmera.Dobri prajmeri mogu osigurati tačnost rezultata detekcije i skratiti vrijeme detekcije (pogledajte dodatak za najčešće korištene prajmere za detekciju).

Napomena: Novodizajnirani prajmeri moraju optimizirati reakcione uvjete i provjeriti tačnost, preciznost i granicu detekcije prije otkrivanja velikih razmjera.

Korak 2

Dizajnirajte eksperimentalni protokol

Pozitivna kontrola: Koristite prečišćenu DNK koja sadrži ciljni fragment kao šablon da biste utvrdili da li su PCR reakcijski sistem i uslovi normalni.

Negativna/prazna kontrola: Koristite DNK šablon ili ddH2O koji ne sadrži ciljni fragment kao šablon da otkrijete da li postoji izvor kontaminacije u PCR sistemu.

Unutrašnja referentna kontrola: koristite kombinaciju prajmera/sonde endogenog gena uzorka koji se testira da biste procenili da li se šablon može detektovati PCR-om.

Biljeska:

Pozitivne, negativne/prazne kontrole i interne kontrole treba postaviti za svaki test kako bi se procijenila valjanost eksperimentalnih rezultata.

Priprema eksperimenta

Prije upotrebe provjerite da li je otopina ravnomjerno izmiješana.Ako se nađe talog, potrebno ga je prije upotrebe otopiti i promiješati prema uputama.2×PCR mješavinu treba pipetirati i više puta miješati mikropipetom prije upotrebe kako bi se izbjegla neravnomjerna raspodjela jona.

Biljeska:

Izvadite priručnik i pažljivo ga pročitajte, te izvršite pripreme prije eksperimenta strogo u skladu sa zahtjevima priručnika.

Korak 4

Pripremite PCR reakcijski sistem

Prema eksperimentalnom protokolu, ravnomjerno pomiješajte prajmere, H2O i 2×PCR mješavinu, centrifugirajte i rasporedite ih u svaku reakcijsku epruvetu.

Biljeska:

Za opsežna ili dugotrajna testiranja, preporučuje se upotreba PCR reakcijskog sistema koji sadrži UNG enzim, koji može efikasno izbjeći aerosolnu kontaminaciju uzrokovanu PCR proizvodima.

Korak 5

Dodajte šablon za reakciju

Koristeći Direct PCR tehnologiju, nema potrebe za zamornim procesom prečišćavanja nukleinske kiseline, šablon uzorka se može pripremiti u roku od 10 minuta, a može se dodati i odgovarajući PCR reakcijski sistem.

Biljeska:

Metoda cijepanja ima bolji efekat detekcije, a dobijeni proizvod se može koristiti za višestruke reakcije detekcije.

5.1: Direktno širenje listova

Prema veličini slike u priručniku, izrežite tkivo lista prečnika 2-3 mm i stavite ga u PCR reakcijski sistem.

Napomena: Osigurajte da su fragmenti lista potpuno uronjeni u PCR reakcijsku otopinu i nemojte dodavati previše tkiva lista.

5.2: Metoda cijepanja lista

Izrežite tkivo lista prečnika 5-7 mm i stavite ga u epruvetu za centrifugu.Ako odaberete zrelo lišće, izbjegavajte korištenje tkiva glavne žile lista.Odpipetirajte 50 ul lizata pufera P1 u epruvetu za centrifugiranje kako biste osigurali da lizat može u potpunosti uroniti tkivo lista, stavite ga u termocikler ili metalnu kupku i lizirajte na 95°C 5-10 minuta.

Dodajte 50 ul otopine za neutralizaciju pufera P2 i dobro promiješajte.Dobijeni lizat se može koristiti kao šablon i dodati u PCR reakcijski sistem.

Napomena: Količina šablona je između 5-10% PCR sistema i ne bi trebalo da prelazi 20% (na primer, u PCR sistem od 20 μl, dodajte 1-2 μl rastvora za lizu, ne više od 4 μl).

Korak 6

PCR reakcija

Nakon centrifugiranja PCR reakcijske epruvete, ona se stavlja u PCR instrument za amplifikaciju.

Biljeska:

Reakcija koristi nepročišćeni šablon za amplifikaciju, tako da je broj ciklusa amplifikacije 5-10 ciklusa veći nego kada se koristi pročišćeni DNK šablon.

Korak 7

Detekcija elektroforezom i analiza rezultata

M: 100bp DNK Ladder

1\4: Metoda prečišćene DNK

2\5: Direktna PCR metoda

3\6: Prazna kontrola

QC:

Rezultati ispitivanja različitih kontrola postavljenih u eksperimentu treba da ispunjavaju sledeće uslove.U suprotnom, potrebno je analizirati uzrok problema i ponoviti test nakon što se problem otkloni.

Tabela 1. Normalni rezultati ispitivanja različitih kontrolnih grupa

*Kada se plazmid koristi kao pozitivna kontrola, rezultat testa endogenog gena može biti negativan

Rezultat presude:

O. Rezultat testa endogenog gena uzorka je negativan, što ukazuje da se DNK pogodna za običnu PCR detekciju ne može izdvojiti iz uzorka ili ekstrahirana DNK sadrži inhibitore PCR reakcije i DNK treba ponovo ekstrahirati.

B. Rezultat testa endogenog gena uzorka je pozitivan, a rezultat testa egzogenog gena negativan, što ukazuje da je iz uzorka ekstrahirana DNK pogodna za običnu PCR detekciju, te se može ocijeniti da gen XXX nije detektovan u uzorku.

C. Rezultat testa endogenog gena uzorka je pozitivan, a rezultat testa egzogenog gena je pozitivan, što ukazuje da je DNK pogodna za običnu PCR detekciju ekstrahirana iz uzorka, a DNK uzorka sadrži XXX gen.Eksperimenti za potvrdu mogu se dalje provoditi.

Korak 8

Dizajn prajmera za detekciju

Nakon eksperimenta, koristite 2% otopinu natrijevog hipoklorita i 70% otopinu etanola da obrišete eksperimentalno područje kako biste spriječili zagađenje okoliša.