Svi pričaju o principu qRT-PCR eksperimenta, dizajnu prajmera, interpretaciji rezultata, itd., ali mislim da bih trebao podijeliti s vama eksperimentalni rad qRT-PCR.Malo je, ali radi se o rezultatima.
Prije nego što uradimo qRT-PCR, moramo jasno razumjeti vlastitu RNK i metode rada.Na kraju krajeva, naši napori su usmjereni na postizanje rezultata, a ne samo na vježbanje.Dakle, prije nego što uradimo qRT-PCR, moramo utvrditi sljedeće probleme (od kojih su neki primjenjivi samo na SYBR).
1 Jeste li sigurni da vaša RNK nije degradirana?
NanoDrop 2000 može detektovati samo koncentraciju i čistoću RNK, ali ne može detektovati integritet RNK.
Vrijednost RNK (broj intenziteta RNK) može odražavati integritet RNK, koji detektuje Agilent 2100 Bioanalyzer sistem.
Slika Šematski dijagram RIN vrijednosti za različite uzorke RNK (eukariote)
Međutim, laboratorije uglavnom nemaju Agilent 2100 bioanalizator.U ovom slučaju možemo detektovati kroz formaldehidni gel, ali je zahtjev za ukupnom količinom RNK veliki, pa je najbrža metoda korištenjem obične gel elektroforeze.Neophodno je da bude u okruženju bez nukleaza, pa je potrebno isprati rezervoar za elektroforezu, bočicu za sol, nosač za gel i češalj DEPC vodom.Agaroza je takođe bez nukleaza (sve dok je sveže otvorena), a pufer za punjenje treba da bude sveže otvoren što je više moguće, sa 1,2% gela.
Imajte na umu da gel mora biti potpuno otopljen, inače će uzrokovati nehomogene trake, kao što je prikazano u uzorku 9 na slici.Ako je napon previsok ili radi predugo, stvorit će toplinu i uzrokovati degradaciju RNK, tako da napon i vrijeme treba razumno kontrolirati.Osim toga, geliranje može dodatno utvrditi da li u uzorku ima ostataka DNK i uočiti postoji li veliki broj zadržanih traka u posudi za doziranje.
Slika.Detekcija RNK gel elektroforezom
2 Jeste li sigurni u koncentraciju vašeg cDNK?
Iskustvo velike braće u laboratoriji je da se cDNK sistema od 20 ul dobijena svakom inverzijom direktno razblaži 20X, dok se sestre nakon doktorskog studija razblaže 10X.Obično zavisim od situacije.Budući da je kvalitet RNK koji spominje svaka osoba različit, nivo preokreta je također različit, a tehnologija preokreta možda neće biti stabilna.
Dakle, svaki put kada dobijem obrnutu cDNK, prvo ću je razrijediti oko 3 puta, a zatim ću koristiti gen za održavanje da uradim RT-PCR, broj ciklusa je općenito 25 ciklusa, da bih identificirao specifičnu koncentraciju, a zatim odredio konačni faktor razrjeđivanja.
3 Jeste li sigurni da su vaši prajmeri jednostavni za korištenje?
Može proći krivulju topljenja qRT-PCR-a, ali to i dalje košta.Za laboratorije bez mnogo novca, kada dobiju puno prajmera, mogu koristiti obični RT-PCR da vide da li je to jedna traka i identifikuju specifičnost prajmera.Ako laboratoriju ne nedostaje novca, specifičnost svih prajmera može se identificirati jednom kroz krivulju topljenja.
4 Jeste li sigurni da su vaši eksperimentalni uvjeti prikladni?
SYBR treba biti zaštićen od jakog svjetla, pa pokušajte isključiti gornje svjetlo kada dodajete SYBR reagens, i trebate koristiti samo prigušeno svjetlo da biste to dovršili.
Čuvati SYBR na 4°C.Kada se koristi, lagano okrenite gore-dolje da se dobro promiješate kako biste izbjegli stvaranje pjene i nemojte snažno vrtložnim miješanjem.
Neke mlađe sestre vole crtati oznake na PCR ploči iz straha da ne pomiješaju uzorke, što je pogrešno.Budući da će vaši markeri vrlo vjerovatno utjecati na prikupljanje fluorescentnih signala, općenito preporučujem juniorima da koriste eksperimentalne bilježnice za pomoć u pamćenju, kao što je prikazano u nastavku.
Slika.qRT-PCR dijagram punjenja uzorka
5 Jeste li sigurni da to radite kako treba?
Obavezno nosite rukavice, nosite rukavice, nosite rukavice i recite važne stvari tri puta.
Kako bih smanjio izloženost SYBR svjetlu, ja lično volim da prvo dodam šablon, kao što je prikazano na slici ispod.Prema iskustvu, dodavanje male količine šablona će vjerovatno uzrokovati greške uzorkovanja.Stoga, kako bih smanjio grešku uzrokovanu dodavanjem male količine šablona, obično ponovo udvostručim uzorak i udvostručim količinu prilikom dodavanja uzorka kako bih smanjio količinu dodane H2O2.
Slika.Šematski dijagram punjenja qRT-PCR
Zatim konfigurišite qRT-PCR sistem na sledeći način.
Slika.Dijagram pripreme qRT-PCR sistema
NAPOMENA: Proces konfiguracije se mora obaviti na ledu.
Nakon dodavanja uzorka, zalijepite prozirnu zaptivnu foliju.Pokušajte ne dodirivati površinu prozirne zaptivne folije rukama, samo operirajte iz prostora s obje strane filma.Zato što otisci prstiju mogu uticati i na prikupljanje fluorescentnih signala.Zatim upotrijebite centrifugu za brzo centrifugiranje 10 s pri maloj brzini kako biste spriječili da uzorak visi na zidu.
Srodni proizvodi:
Vrijeme objave: Apr-28-2023
