PCR (lančana reakcija polimeraze) je jedna od tehnologija in-vitro amplifikacije DNK, sa istorijom dužom od 30 godina.

PCR tehnologiju je pionir Kary Mullis iz Cetusa, SAD 1983. Mullis se prijavio za PCR patent 1985. i objavio prvi PCR akademski rad o nauci iste godine.Mullis je za svoj rad dobio Nobelovu nagradu za hemiju 1993. godine.

Osnovni principi PCR-a

PCR može pojačati fragmente ciljne DNK više od milion puta.Princip je pod katalizom DNK polimeraze, koristeći roditeljski lanac DNK kao šablon i specifičan prajmer kao početnu tačku za produžavanje.Replicira se in vitro kroz korake kao što su denaturacija, žarenje i ekstenzija.Proces DNK kćeri lanca komplementaran matičnom lancu DNK šablona.

Standardni PCR proces podijeljen je u tri koraka:

1. Denaturacija: Koristite visoku temperaturu za razdvajanje dvostrukih lanaca DNK.Vodikova veza između dvostrukih lanaca DNK prekida se na visokoj temperaturi (93-98℃).

2. Žarenje: Nakon što se dvolančana DNK odvoji, snizite temperaturu tako da se prajmer može vezati za jednolančanu DNK.

3. Ekstenzija: DNK polimeraza počinje sintetizirati komplementarne lance duž lanaca DNK od vezanih prajmera kada se temperatura spusti.Kada je proširenje završeno, ciklus je završen, a broj fragmenata DNK se udvostručuje

Uzvraćanjem ova tri koraka 25-35 puta, broj fragmenata DNK će se eksponencijalno povećati.

Genijalnost PCR-a je u tome što se različiti prajmeri mogu dizajnirati za različite ciljne gene, tako da se fragmenti ciljnog gena mogu amplificirati u kratkom vremenskom periodu.

Do sada se PCR može podijeliti u tri kategorije, a to su obični PCR, fluorescentni kvantitativni PCR i digitalni PCR.

Prva generacija običnog PCR-a

Upotrijebite običan PCR instrument za amplifikaciju za amplifikaciju ciljnog gena, a zatim koristite elektroforezu u agaroznom gelu za detekciju proizvoda, može se napraviti samo kvalitativna analiza.

Glavni nedostaci prve generacije PCR-a:

1. Sklon nespecifičnom pojačavanju i lažno pozitivnim rezultatima.

2. Detekcija traje dugo i operacija je glomazna.

3.Može se uraditi samo kvalitativni test

Druga generacija PCR u realnom vremenu

PCR u realnom vremenu, također poznat kao qPCR, koristi fluorescentne sonde koje mogu ukazati na napredak reakcionog sistema, i prati akumulaciju pojačanih produkata kroz akumulaciju fluorescentnih signala i procjenjuje rezultate kroz krivu fluorescencije.Može se kvantificirati uz pomoć vrijednosti Cq i standardne krive.

Budući da se qPCR tehnologija provodi u zatvorenom sistemu, vjerovatnoća kontaminacije je smanjena, a signal fluorescencije se može pratiti za kvantitativnu detekciju, tako da je u kliničkoj praksi najšire korištena i postala dominantna tehnologija u PCR-u.

Fluorescentne supstance koje se koriste u fluorescentnom kvantitativnom PCR-u u realnom vremenu mogu se podijeliti na: TaqMan fluorescentnu sondu, molekularne svjetionike i fluorescentnu boju.

1)TaqMan fluorescentna sonda:

Tokom PCR amplifikacije dodaje se specifična fluorescentna sonda uz dodavanje para prajmera.Sonda je oligonukleotid, a oba kraja su označena reporterskom fluorescentnom grupom i fluorescentnom grupom za gašenje.

Kada je sonda netaknuta, fluorescentni signal koji emituje reporterska grupa apsorbuje grupa za gašenje;tokom PCR amplifikacije, 5′-3′ egzonukleazna aktivnost enzima Taq cijepa i degradira sondu, čineći reportersku fluorescentnu grupu i gasitelj. scenski signal je potpuno sinhronizovan sa formiranjem PCR proizvoda.

2) SYBR fluorescentna boja:

U PCR reakcijskom sistemu dodaje se višak SYBR fluorescentne boje.Nakon što je SYBR fluorescentna boja nespecifično ugrađena u dvostruki lanac DNK, emituje fluorescentni signal.Molekul boje SYBR koji nije ugrađen u lanac neće emitovati nikakav fluorescentni signal, čime se osigurava fluorescentni signal. Povećanje PCR proizvoda je potpuno sinhronizovano sa povećanjem PCR proizvoda.SYBR se vezuje samo za dvolančanu DNK, tako da se krivulja topljenja može koristiti za određivanje da li je PCR reakcija specifična.

3) Molekularni far:

To je dvostruko obilježena oligonukleotidna sonda u obliku petlje koja formira strukturu ukosnice od oko 8 baza na 5 i 3 kraja.Sekvence nukleinskih kiselina na oba kraja su komplementarno uparene, što uzrokuje da fluorescentna grupa i grupa za gašenje budu čvrste.Zatvori, neće se proizvoditi fluorescencija.

Nakon što se PCR proizvod generira, tokom procesa žarenja, srednji dio molekularnog svjetionika se uparuje sa specifičnom sekvencom DNK, a fluorescentni gen se odvaja od gena za gašenje kako bi se proizvela fluorescencija.

Glavni nedostaci PCR druge generacije:

Osjetljivost još uvijek nedostaje, a detekcija uzoraka sa malo kopije je netačna.

Postoji uticaj pozadinske vrednosti, a rezultat je podložan smetnjama.

Kada postoje PCR inhibitori u reakcionom sistemu, rezultati detekcije su podložni smetnjama.

Digitalni PCR treće generacije

Digitalni PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) izračunava broj kopija ciljne sekvence kroz detekciju krajnje tačke i može izvršiti tačnu apsolutnu kvantitativnu detekciju bez upotrebe internih kontrola i standardnih krivulja.

Digitalni PCR koristi detekciju krajnje tačke i ne zavisi od vrednosti Ct (prag ciklusa), tako da je digitalna PCR reakcija manje pogođena efikasnošću amplifikacije, a tolerancija na inhibitore PCR reakcije je poboljšana, sa visokom preciznošću i reproduktivnošću.

Zbog karakteristika visoke osjetljivosti i visoke tačnosti, inhibitori PCR reakcije ga ne ometaju lako i može postići pravu apsolutnu kvantifikaciju bez standardnih proizvoda, što je postalo žarište istraživanja i primjene.

Prema različitim oblicima reakcione jedinice, može se podijeliti u tri glavna tipa: mikrofluidni, čip i sistemi kapljica.

1) Mikrofluidni digitalni PCR, mdPCR:

Na osnovu mikrofluidne tehnologije, DNK šablon je odvojen.Mikrofluidna tehnologija može realizovati nano-nadogradnju uzorka ili stvaranje manjih kapljica, ali za kapljice je potrebna posebna metoda adsorpcije, a zatim u kombinaciji sa PCR reakcijskim sistemom.mdPCR je postepeno usvajan drugim metodama.

2) Digitalni PCR baziran na kapljicama, ddPCR:

Koristite tehnologiju stvaranja kapljica vode u ulju za obradu uzorka u kapljice i podijelite reakcioni sistem koji sadrži molekule nukleinske kiseline na hiljade kapljica nano razmjera, od kojih svaka ne sadrži ciljni molekul nukleinske kiseline koji treba detektirati, ili sadrži jedan do nekoliko ciljnih molekula nukleinske kiseline za testiranje.

3) Digitalni PCR baziran na čipu, cdPCR:

Koristite tehnologiju integriranog puta fluida za graviranje mnogih mikrotuba i mikrošupljina na silikonskim pločicama ili kvarcnom staklu i kontrolirajte protok otopine kroz različite kontrolne ventile i podijelite tekućinu uzorka na nanometre iste veličine u reakcione jažice za digitalnu PCR reakciju kako biste postigli apsolutnu kvantifikaciju.

Glavni nedostaci PCR treće generacije:

Oprema i reagensi su skupi.

Zahtjevi za kvalitetom šablona su visoki.Ako količina šablona premašuje količinu mikrosistema, biće nemoguće kvantificirati, a ako je premala, tačnost kvantifikacije će biti smanjena.

Lažno pozitivni rezultati se također mogu generirati kada postoji nespecifično pojačanje.