PCR, višestruko PCR, In situ PCR, Reverzni PCR, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

Razvrstati ćemo koncepte, korake i detalje različitih PCR-a

Ⅰ. PCR

Lančana reakcija polimeraze, poznata kao PCR, je molekularna biološka tehnologija koja se koristi za povećanje specifičnih fragmenata DNK.Može se smatrati posebnom replikacijom DNK in vitro.DNK polimeraza (DNK polimeraza I) otkrivena je još 1955. godine, a Klenow fragment E. Coli, koji ima eksperimentalnu vrijednost i praktičnost, otkrio je dr. H. Klenow ranih 1970-ih, ali pošto ovaj enzim ne podnosi temperaturu, visoka temperatura ga može degenerirati, tako da ne dolazi do degeneracije lančane reakcije visoke temperature.Enzimi koji se danas koriste (nazvani Taq polimeraza) izolovani su iz Thermus aquaticus, bakterije vrelog izvora 1976. godine. Njena karakteristika je da može izdržati visoke temperature i idealan je enzim, ali se široko koristi nakon 1980-ih.Originalni koncept prvobitnog primitivnog prototipa PCR-a sličan je popravljanju i kopiranju gena, koji je predložio dr. KJell Kleppe 1971. godine. On je objavio prvu jednostavnu i kratkoročnu kopiju gena (slično kao u prva dva ciklusa reakcija PCR-a).Danas razvijeni PCR razvio je dr. Kary B. Mullis 1983. Dr. Mullis je te godine služio PE kompanijama, tako da PE ima poseban status u PCR industriji.Dr. Mullis je službeno objavio prvi srodni rad sa Saikijem i drugima 1985. Od tada, korištenje PCR-a je hiljadama milja dnevno, a može se reći da kvalitet srodnih radova čini mnoge druge istraživačke metode neukusnim.Nakon toga, PCR tehnologija se široko koristi u biološkim naučnim istraživanjima i kliničkim aplikacijama, postajući najvažnija tehnologija istraživanja molekularne biologije.Mullis je također dobio Nobelovu nagradu za hemiju 1993.

PCRPrincip

Osnovni princip PCR tehnologije sličan je prirodnom procesu replikacije DNK, a njegova specifičnost ovisi o oligonukleotidnom prajmeru koji je komplementaran oba kraja ciljne sekvence.PCR se sastoji od tri osnovne reakcije degeneracije-žarenja-proširivanja: ①Degeneracija šablonske DNK: Nakon što se DNK šablona zagrije na oko 93°C u određenom vremenskom periodu, otopina dvostruke DNK za dvolančanu DNK formirana PCR-om amplifikacijom DNK šablona Odlaskom, može se pretvoriti u jedan okrugli lanac za reakciju kako bi se pripremio za sljedeći lanac.②Spajanje (spoj) DNK šablona i prajmera: Nakon što se DNK šablona zagreje i degeneriše u jedan lanac, temperatura pada na oko 55°C.Komplementarna sekvenca prajmera i šablona DNK jednolančana.③Proširenje prajmera: DNK šablon-vezivanje prajmera zasniva se na delovanju TaqDNA polimeraze, sa dNTP kao sirovinom reakcije.Zadržite princip replikacije, sintetizirajte novi polu-rezervirani lanac kopiranja koji nadopunjuje šablonski lanac DNK, i ponovite ciklus degeneracija-žarenje-produženje tri procesa mogu dobiti više "polu-rezerviranog lanca kopiranja", a ovaj novi lanac je ponovo dostupan. Postanite predložak za sljedeći ciklus.Potrebno je 2-4 minuta da se završi petlja, ciljni gen se može pojačati nekoliko miliona puta za 2-3 sata.

StandardPCRReakcioni sistem

Pet elemenata PCR reakcije

U PCR reakciji je uglavnom uključeno pet vrsta supstanci, a to su prajmer, enzim, dNTP, šablon i pufer (potreban je Mg2+).[PCR procedura]

Standardni PCR proces podijeljen je u tri koraka

1. Degeneracija DNK (90°C-96°C): Dvolančani DNK šabloni pod termičkim djelovanjem, vodonične veze pucaju, formirajući jednolančanu DNK.

2. Žarenje (25℃ -65℃): Temperatura sistema se smanjuje, prajmer se kombinuje sa DNK šablonom da bi se formirao lokalni dvostruki lanac.

3. Produžetak (70℃ -75℃): Pod dejstvom Taq enzima (oko 72°C, najbolja aktivnost), dNTP se koristi kao sirovina, proteže se od 5′ kraja prajmera → 3′ kraja, sinteza i šablon se međusobno dopunjuju lanac DNK.

Svaki ciklus se denaturira, žari i produžava, udvostručujući sadržaj DNK.Trenutno, zbog kratkog područja amplifikacije, neki PCR se može replicirati u vrlo kratkom vremenu čak i ako aktivnost Taq enzima nije optimalna, pa se može promijeniti u dva koraka, odnosno žarenje i ekstenzija se mogu izvoditi na 60°C-65°C istovremeno.U cilju smanjenja procesa podizanja i hlađenja i poboljšanja brzine odziva.

Karakteristike PCR reakcije

● Visoka specifičnost

Specifični odlučujući faktori PCR odgovora su: ①Specifična kombinacija prajmera i DNK šablona.②Princip uparivanja baza.③Lojalnost reakcije sinteze TaqDNA polimeraze.④Specifičnost i konzervativnost ciljnog gena.

Ispravna kombinacija prajmera i šablona je ključ.Vezivanje prajmera i šablona i produžavanje lanca prajmera zasniva se na principu podudarnosti alkalnih baza.Odanost reakcija sinteze polimeraze i otpornost na visoke temperature Taq DNK polimeraze da bi se vezivanje (spoj) šablona i prajmera u reakciji moglo izvesti na višoj temperaturi.Specifičnost kombinacije je znatno povećana.Klip može održati visok stepen ispravnosti.Odabirom ciljne genetske regije sa visokom konzervativnošću i visokom konzervativnošću, njegova specifičnost je veća.

● Visoka osetljivost

Obim proizvodnje PCR proizvoda se povećava za indeks, koji može proširiti početni šablon Picker-a (PG=10-12) kako bi se nivo mikrokontrolera povećao na nivo mikrograma (μg= -6).Ciljne ćelije se mogu detektovati iz 1 milion ćelija;u detekciji virusa, osetljivost PCR može da dostigne 3 RFU (prazne tačke formirane jedinice);minimalna stopa otkrivanja u bakterijskoj nauci je 3 bakterije.

● Jednostavno i brzo

PCR refleksija koristi visokotemperaturnu Taq DNK polimerazu, koja dodaje reakcionu otopinu u jednom trenutku, odnosno reakciju degeneracije-žarenja-ekstenzije na otopinu za amplifikaciju DNK i lonac u vodenom kupatilu.Generalno, reakcija amplifikacije se završava za 2 do 4 sata.Prošireni proizvodi se uglavnom analiziraju električnim mačem i ne moraju koristiti izotope, bez radioaktivnog zagađenja i laku promociju.

● Čistoća uzorka je niska

Nema potrebe za razdvajanjem virusa ili bakterija i ćelija kulture.Sirovi proizvodi DNK i RNK mogu se koristiti kao pojačivači.Detekcija DNK amplifikacije može se koristiti direktno koristeći kliničke uzorke kao što su krv, tjelesna tekućina, tekućina za pranje kašlja, kosa, ćelije i živo tkivo.

PCRuobičajeni problemi

● Lažno negativan, bez pojačanih traka

Ključne faze PCR reakcije uključuju: ① pripremu šablonskih nukleinskih kiselina, ② kvalitet i specifičnost prajmera, ③ kvalitet enzima ④ uslove PCR ciklusa.Pronalaženje razloga također treba analizirati i proučiti za gornje veze.

Šabloni: ① Šablon sadrži razne proteine, ② Šablon sadrži inhibitor enzima Taq, ③ Protein u šablonu se ne eliminiše, posebno protein grupe u hromozomu.⑤ Deminerska degeneracija nukleinske kiseline nije temeljita.Kada je kvalitet enzima i prajmera dobar, ne postoji pojas za pojačavanje, što je najvjerovatnije digestivni tretman uzoraka.Nešto nije u redu sa šablonskim procesom ekstrakcije nukleinske kiseline, tako da za pripremu efikasnog i stabilnog rastvora za varenje, njegovu proceduru treba fiksirati, a ne proizvoljno menjati.

Inaktivacija enzima: novi enzim ili i stari i novi enzimi trebaju se koristiti zajedno da se analizira da li je aktivnost enzima izgubljena ili nedovoljna, što dovodi do lažno negativnih rezultata.Treba napomenuti da se ponekad zaboravlja Taq enzim ili etidijum bromid.

Primer: kvaliteta prajmera, koncentracija prajmera i da li je koncentracija dva prajmera simetrična.To je čest razlog za neuspjeh PCR-a ili rastući pojas nije idealan i sklon difuziji.Postoje problemi s kvalitetom prajmera nekih serija.Dva prajmera imaju visoku koncentraciju i nisku koncentraciju, uzrokujući nisku efikasnost asimetrične amplifikacije.Protumjere su: ① Odaberite dobar prajmer za sintezu jedinica.② Koncentracija prajmera ne zavisi samo od OD vrednosti, već takođe obraća pažnju na originalnu tečnost prajmera da bi se napravila elektroforeza u šećernom gelu u agaru.Mora postojati zona trake prajmera, a svjetlina dva prajmera bi općenito trebala biti dosljedna.Pojas, PCR može pokvariti u ovom trenutku, i to bi trebalo riješiti s jedinicom za sintezu prajmera.Ako je prajmer visok, svjetlina je niska, a njegova koncentracija mora biti uravnotežena kada se razrijedi.③ Prajmer treba platiti i čuvati u visokoj koncentraciji kako bi se spriječilo višestruko smrzavanje ili dugotrajno hlađenje dijelova hladnjaka, što će uzrokovati propadanje i degradaciju prajmera.④ Dizajn prajmera je nerazuman, kao što je dužina prajmera nedovoljna, a di klaster se formira između prajmera.

Koncentracija Mg2+: Koncentracija Mg2+iona ima veliki uticaj na efikasnost PCR amplifikacije.Prekomjerna koncentracija može smanjiti PCR amplifikaciju suprotnog spola.Ako je koncentracija preniska, izlaz PCR amplifikacije će čak dovesti do neuspjeha PCR amplifikacije bez pojasa ekspanzije.

Promjena zapremine reakcije: Volumen koji se koristi u PCR amplifikaciji je 20ul, 30ul i 50ul ili 100uL, veliki volumen aplikacije za PCR amplifikaciju je postavljen prema različitim svrhama naučnog istraživanja i kliničkog testiranja.Nakon izrade malih količina kao što je 20ul, potrebno je napraviti kondiciju kabla prilikom izrade veličine, inače će propasti.

Fizički razlozi: Transformacija je veoma važna za PCR amplifikaciju.Ako je temperatura degeneracije niska, vrijeme degeneracije je kratko, vjerojatno će se pojaviti u lažno negativnim;preniska temperatura žarenja može uzrokovati nespecifično pojačanje i smanjiti efikasnost specifične amplifikacije.Jako utiču na kombinaciju prajmera i šablona kako bi se smanjila efikasnost PCR amplifikacije.Ponekad je potrebno koristiti standardne termometre za detekciju varijabilnosti, žarenja i produžene temperature u produžetku ili kuhalu rastvorljivom u vodi, što je jedan od razloga kvara PCR-a.

Varijante ciljne sekvence: Ako dođe do ciljne sekvence, mutacije ili delecije, kombinacija prototipa i šablona se kombinuje, ili zbog nedostatka ciljne sekvence, prajmer i šablon će izgubiti komplementarnu sekvencu, a njena PCR amplifikacija neće biti uspešna.

● Lažno pozitivan

PCR amplifikaciona traka izgleda u skladu sa trakom ciljne sekvence, a ponekad je njena traka urednija i viša.

Dizajn prajmera nije prikladan: odabrana sekvenca amplifikacije i nenamjenska amplifikacijska sekvenca su homologne, tako da kada PCR amplifikacija, amplificirani PCR proizvodi su nenamjenske sekvence.Ciljna sekvenca je prekratka ili je prajmer prekratak i sklon je lažno pozitivnim rezultatima.Treba redizajnirati.

Unakrsno zagađenje ciljne sekvence ili produkata amplifikacije: Dva su razloga za ovo zagađenje: Prvo, unakrsno zagađenje cijelog genoma ili velikih segmenata, što dovodi do lažnih pozitivnih rezultata.Ova vrsta lažno pozitivnih može se riješiti sljedećim metodama: Budite pažljivi i nježni tokom rada kako biste spriječili da ciljna sekvenca udahne u pištolj za uzorke ili prska iz centrifugalne cijevi.Osim enzima i tvari koje ne podnose visoke temperature, sve reagense ili opremu treba dezinficirati visokim pritiskom.Centrifugalne cijevi i uzorke treba koristiti odjednom.Kada je potrebno, prije dodavanja uzoraka, reakcijska cijev i reagens se izlažu ultraljubičastim zracima kako bi se uništila postojeća nukleinska kiselina.Drugo, mali fragmenti u zagađenju vazduha.Ovi mali fragmenti su kraći od ciljne sekvence, ali imaju određenu homologiju.Može se spajati jedno s drugim.Nakon dopune prajmera, PCR proizvod se može proširiti, što će uzrokovati lažno pozitivnu proizvodnju.Može se koristiti za smanjenje ili eliminaciju nest PCR metode.

● Pojavljuje se nespecifični pojas pojačanja

Trake koje su se pojavile nakon PCR amplifikacije nisu u skladu s očekivanom veličinom, velike ili male, ili istovremeno, ili u isto vrijeme, specifične amplifikacijske trake i nespecifične amplifikacijske trake.Pojava nespecifičnih traka je: Prvo, prajmeri su nekompletni komplementarni ciljnoj sekvenci, ili polimerizacija prajmera da bi se formirao di klaster.Drugi je da je koncentracija MG2+ jona previsoka, temperatura žarenja preniska, a broj PCR ciklusa je povezan.Drugo, kvaliteta i količina enzima.Često su enzimi nekih izvora skloni nespecijalnim trakama, a enzimi drugog izvora se ne pojavljuju.Ponekad se javlja i nespecifična amplifikacija enzima.Protumjere su: redizajn atraktivnosti ako je potrebno.Smanjite količinu enzima ili zamijenite enzim drugog izvora.Smanjite količinu primarnih, povećajte količinu šablona na odgovarajući način i smanjite broj ciklusa.Pravilno povećajte temperaturu žarenja ili koristite metodu dvije temperaturne točke (degeneracija od 93°C, žarenje i proširenje na oko 65°C).

● Pojavljuje se ljuskava vuča ili razmazana traka

Ponekad se čini da je PCR amplifikacija primijenjena ili obložena ili pojasom nalik na tepih.Iz razloga, zbog prevelike količine enzima ili lošeg kvaliteta enzima, koncentracija dNTP je previsoka, koncentracija Mg2+ je previsoka, temperatura žarenja je preniska, a broj ciklusa je prevelik.Protumjere su: ①Smanjite količinu enzima ili promijenite enzim drugog izvora.②Smanjite koncentraciju dNTP ③Propisno smanjite koncentraciju Mg2+.④Povećajte količinu šablona i smanjite broj ciklusa.

Srodni proizvodi

PCR Heroᵀᴹ (sa bojom)

◮ Veća vjernost: 6 puta veća od običnog Taq enzima;

◮ Veća brzina pojačanja

◮ Više prilagodljivosti šablona

◮ Veća efikasnost pojačanja

◮ Tolerancija okoline je jača: postavljena na 37°C nedelju dana, održavajući više od 90% aktivnosti;

◮ Ima aktivnost 5'→3' DNK polimeraze i 5'→3' egzonukleazne aktivnosti, bez aktivnosti 3'→5' egzonukleaze.

PCR Easyᵀᴹ (sa bojom)

Jedinstveni sistem reakcije i visokoefikasna Taq DNK polimeraza čine da PCR reakcija ima veću efikasnost amplifikacije, specifičnost i osjetljivost.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Jedan korak)-SYBR Green I

◮ Komplet u jednom koraku čini reverznu transkripciju i qPCR dvije reakcije u istoj epruveti, potrebno je samo dodati šablonsku RNA, specifične PCR prajmere i ddH bez RNase₂O.

◮ Komplet može brzo i efikasno kvantitativno analizirati virusnu RNK ili RNK u tragovima.

◮ Komplet koristi jedinstveni Foregene reagens reverzne transkripcije i Foregene HotStar Taq DNK polimerazu u kombinaciji sa jedinstvenim reakcionim sistemom za efikasno poboljšanje efikasnosti amplifikacije i specifičnosti reakcije.

◮ Optimizovani sistem reakcije čini da reakcija ima veću osetljivost detekcije, veću termičku stabilnost i bolju toleranciju.

◮ RT-qPCR Easy^TM(One Step)-SYBR Green I komplet dolazi sa ROX internom referentnom bojom, koja se može koristiti za eliminaciju signalne pozadine i grešaka signala između bunara, što je zgodno za korisnike za korištenje u različitim modelima kvantitativnih PCR instrumenata.

RT Easy^TMII (Master premiks za sinteza prvog lanca cDNK zaPCR u realnom vremenu)

-Efikasna sposobnost uklanjanja gDNK, koja može ukloniti gDNK u šablonu u roku od 2 minute.

- Efikasan sistem reverzne transkripcije, potrebno je samo 15 minuta da se završi sinteza prvog lanca cDNK.

-Složeni šabloni: šabloni sa visokim sadržajem GC i složenom sekundarnom strukturom se takođe mogu obrnuti sa velikom efikasnošću.

- Visokoosjetljivi sistem reverzne transkripcije, šabloni na nivou pg također mogu dobiti visokokvalitetnu cDNK.

-Sistem obrnute transkripcije ima visoku termičku stabilnost, optimalna temperatura reakcije je 42℃, a i dalje ima dobre performanse reverzne transkripcije na 50℃.