Nekoliko revolucionarnih izuma u istoriji tehnologije detekcije u mom umu su tehnologija imuno-obeležavanja zasnovana na principu specifičnog vezivanja antigen-antitelo, PCR tehnologija i tehnologija sekvenciranja.Danas ćemo govoriti o PCR tehnologiji.Prema evoluciji PCR tehnologije, ljudi uobičajeno dijele PCR tehnologiju u tri generacije: običnu PCR tehnologiju, fluorescentnu kvantitativnu PCR tehnologiju u realnom vremenu i digitalnu PCR tehnologiju.
Cuobičajena PCR tehnika
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis je izumio lančanu reakciju polimeraze (polymerase chain response, PCR) 1983. godine. Kažu da je, dok je vozio svoju djevojku, iznenada dobio bljesak inspiracije i pomislio na princip PCR (o prednostima vožnje).Kary Mullis je dobio Nobelovu nagradu za hemiju 1993. New York Times je komentirao: „Veoma originalan i značajan, gotovo dijeli biologiju na pre-PCR i post-PCR ere.
Princip PCR-a: Pod katalizom DNK polimeraze, DNK matičnog lanca se koristi kao šablon, a specifični prajmer se koristi kao početna tačka ekstenzije, a DNK kćeri lanca komplementarna DNK šablona matičnog lanca se kopira in vitro denaturacijom, žarenjem, ekstenzijom i drugim koracima.To je tehnologija amplifikacije DNK sinteze in vitro, koja može brzo i specifično pojačati bilo koju ciljnu DNK in vitro.
Prednosti običnog PCR-a
1.Klasična metoda, potpuni međunarodni i domaći standardi
2.Niža cijena reagensa za instrumente
3.PCR proizvodi se mogu dobiti za druge eksperimente molekularne biologije
Preporučeni Foregene PCR uređaj: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Povezani proizvodi: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Nedostaci običnog PCR-a
1.lako zagaditi
2.glomazna operacija
3.samo kvalitativna analiza
4.Umjerena osjetljivost
5.Postoji nespecifično pojačanje, a kada je nespecifična traka iste veličine kao ciljna, ne može se razlikovati
CPCR na bazi apilarne elektroforeze
Kao odgovor na nedostatke običnog PCR-a, neki proizvođači su uveli instrumente zasnovane na principu kapilarne elektroforeze.Korak elektroforeze nakon PCR amplifikacije je završen u kapilari.Osetljivost je veća, a razlika nekoliko baza se može razlikovati i pojačanje se može izračunati pomoću MAERKER-a.sadržaj proizvoda.Nedostatak je što PCR proizvod još uvijek treba otvoriti i staviti u instrument, a i dalje postoji veliki rizik od kontaminacije.
CapilarniEelektroforeza
2. fluorescentna kvantitativna PCR tehnologija u realnom vremenu (Quantitative Real-time PCR, qPCR)Fluorescentni kvantitativni PCR, takođe nazvan PCR u realnom vremenu, je nova kvantitativna tehnologija nukleinske kiseline koju je razvio PE (Perkin Elmer) 1995. Istorija razvoja fluorescentnog kvantitativnog PCR-a je istorija uzbudljivih borbi divova kao što su ABI, Roche i Bio-Rad.Ako ste zainteresovani, možete pogledati.Ova tehnika je trenutno najzrelija i široko korištena polukvantitativna PCR tehnika.
Preporučena qPCR mašina: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Metoda fluorescentne boje (SYBR Green I):SYBR Green I je najčešće korištena DNK-vezujuća boja za kvantitativni PCR, koja se nespecifično vezuje za dvolančanu DNK.U slobodnom stanju, SYBR Green emituje slabu fluorescenciju, ali kada se jednom veže za dvolančanu DNK, njegova fluorescencija se povećava 1000 puta.Stoga je ukupni fluorescentni signal koji emituje reakcija proporcionalan količini prisutne dvolančane DNK i povećavat će se s povećanjem amplificiranog proizvoda.Budući da se boja nespecifično veže za dvolančanu DNK, mogu se dobiti lažno pozitivni rezultati.
Povezani proizvodi: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Metoda fluorescentne sonde (Taqman tehnologija): TokomPCR amplifikacija, specifična fluorescentna sonda se dodaje u isto vrijeme kao i par prajmera.Sonda je linearni oligonukleotid, sa fluorescentnom reporterskom grupom i fluorescentnom grupom za gašenje označene na oba kraja.Kada je sonda netaknuta, fluorescentni signal koji emituje reporterska grupa apsorbuje grupa za gašenje, a detekcija Nema fluorescentnog signala;tokom PCR amplifikacije (u fazi ekstenzije), 5'-3' Dicer aktivnost Taq enzima će probaviti i degradirati sondu, tako da se reporterska fluorescentna grupa i gasiteljska fluorescentna grupa razdvoje, tako da se sistem za praćenje fluorescencije može primiti fluorescentni signal, tj. fluorescentni signali i formiranje PCR proizvoda.Metoda Taqman sonde je najčešće korištena metoda detekcije u kliničkoj detekciji.
Povezani proizvodi: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Prednosti qPCR-a
1.Metoda je zrela i prateća oprema i reagensi su kompletni
2.Srednja cijena reagensa
3.jednostavan za korištenje
4.Visoka osjetljivost i specifičnost detekcije
Nedostaci qPCR-a
Mutacija ciljnog gena dovodi do promašene detekcije.
Rezultat detekcije šablona niske koncentracije ne može se odrediti.
Postoji velika greška kada se koristi standardna krivulja za kvantitativnu detekciju.
3. Digital PCR (digitalni PCR, dPCR) tehnologija
Digitalni PCR je tehnika za apsolutnu kvantifikaciju molekula nukleinske kiseline.U poređenju sa qPCR, digitalni PCR može direktno očitati broj molekula DNK/RNA, što je apsolutna kvantifikacija molekula nukleinske kiseline u početnom uzorku.Godine 1999. Bert Vogelstein i Kenneth W. Kin-zler su formalno predložili koncept dPCR-a.
Fluidigm je 2006. godine prvi proizveo komercijalni dPCR instrument baziran na čipu.Godine 2009. Life Technologies je lansirao OpenArray i QuantStudio 12K Flex dPCR sisteme.U 2013. godini, Life Technologies je lansirao QuantStudio 3DdPCR sistem, koji koristi tehnologiju mikrofluidnih čipova visoke gustine za ravnomjernu distribuciju uzoraka na 20.000 pojedinačnih ćelija.u reakcionoj bušotini.
Godine 2011. Bio-Rad je lansirao QX100 dPCR instrument baziran na kapljicama, koji koristi tehnologiju voda u ulju za ravnomjernu distribuciju uzorka na 20.000 kapljica vode u ulju i koristi analizator kapljica za analizu kapljica.U 2012. godini RainDance je lansirao RainDrop dPCR instrument, pokretan plinom pod visokim pritiskom, kako bi podijelio svaki standardni reakcioni sistem u reakcionu emulziju koja sadrži 1 milion do 10 miliona mikrokapljica na nivou pikolitara.
Do sada je digitalni PCR formirao dvije velike frakcije, tip čipa i tip kapljice.Bez obzira na vrstu digitalnog PCR-a, njegovi osnovni principi su ograničavanje razrjeđivanja, PCR krajnje tačke i Poissonova distribucija.Standardni PCR reakcijski sistem koji sadrži šablone nukleinskih kiselina ravnomjerno je podijeljen na desetine hiljada PCR reakcija, koje se raspoređuju na čipove ili mikrokapljice, tako da svaka reakcija sadrži što više molekula šablona, a izvodi se jednomolekulska šablonska PCR reakcija.Čitanjem fluorescencije Broji se prisustvo ili odsustvo signala, a apsolutna kvantifikacija se vrši nakon kalibracije statističke Poissonove distribucije.
Ovo su karakteristike nekoliko digitalnih PCR platformi koje sam koristio:
1. Bio-Rad QX200 digitalni PCR Bio-RadQX200 je vrlo klasična digitalna PCR platforma, osnovni proces detekcije: 20.000 uzoraka generira se generatorom kapljica. Mikro-kapljice vode u ulju se pojačavaju na običnoj PCR mašini, a na kraju se fluorescentni signal svake mikrokapljice očitava čitačem mikrokapljica.Operacija je složenija, a rizik od zagađenja je srednji.
Xinyi TD1 mikro-kapljični digitalni PCRXinyi TD1 je domaća digitalna PCR platforma, osnovni proces detekcije: generiše 30.000-50.000 kapljica vode u ulju kroz generator kapljica, pojačava na uobičajenom PCR instrumentu i na kraju propušta Čitač kapljica čita fluorescentni signal svake kapljice.Generisanje kapljica i očitavanje na ovoj platformi se obavljaju u namenskom čipu sa niskim rizikom od kontaminacije.
STILLA Naica mikro-kapljični čip digitalni PCRSTILLA Naica je relativno nova digitalna PCR platforma.Osnovni proces detekcije je: dodati reakcijski rastvor u čip, staviti čip u sistem za generisanje i pojačavanje mikro-kapljica i generisati 30.000 mikro-kapljica.Širenje na čipu i PCR amplifikacija je završena na čipu.Zatim se pojačani čip prenosi u sistem za analizu čitanja mikrokapljica, a fluorescentni signal se očitava slikanjem.Budući da se cijeli proces odvija u zatvorenom čipu, rizik od kontaminacije je nizak.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D čip digitalni PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D je još jedna klasična digitalna PCR platforma bazirana na čipu.Njegov osnovni proces detekcije je: dodajte reakcijsku otopinu u raspršivač i ravnomjerno rasporedite reakcijsku otopinu po čipu sa 20.000 mikro jažica kroz raspršivač., stavite čip na PCR mašinu da se pojača, i na kraju stavite čip u čitač i snimite fotografiju da pročitate fluorescentni signal.Operacija je relativno složena, a cijeli proces se odvija u zatvorenom čipu, a rizik od kontaminacije je nizak.
5. JN MEDSYS Clarity čip digitalni PCR
JN MEDSYS Clarity je relativno nova digitalna PCR platforma tipa čip.Njegov osnovni proces detekcije je: dodajte reakcionu otopinu u aplikator i ravnomjerno rasporedite reakcijsku otopinu na 10.000 PCR epruveta pričvršćenih u PCR epruvetu kroz aplikator.Na mikroporoznom čipu reakciona otopina kapilarnim djelovanjem ulazi u čip, a PCR cijev sa čipom se postavlja na PCR mašinu za amplifikaciju, a na kraju se čip stavlja u čitač da očita fluorescentni signal fotografisanjem.Operacija je komplikovanija.Rizik od kontaminacije je nizak.
Parametri svake digitalne PCR platforme su sažeti na sljedeći način:
Indikatori evaluacije digitalne PCR platforme su: broj split jedinica, broj fluorescentnih kanala, složenost rada i rizik od kontaminacije.Ali najvažnija stvar je tačnost detekcije.Jedan od načina za procjenu digitalnih PCR platformi je korištenje više digitalnih PCR platformi za provjeru jedne druge, a drugi način je korištenje standardnih supstanci s tačnim vrijednostima.
Prednosti dPCR-a
1.Postizanje apsolutne kvantifikacije
2.Veća osjetljivost i specifičnost
3.Može otkriti uzorke niske kopije
Nedostaci dPCR-a1. Skupa oprema i reagensi 2. Komplikovana operacija i dugo vrijeme detekcije 3. Uski raspon detekcije
Trenutno, tri generacije PCR tehnologije imaju svoje prednosti i nedostatke, i svaka ima svoja polja primjene, i nije odnos da jedna generacija zamjenjuje drugu.Kontinuirani napredak tehnologije ubrizgao je novu vitalnost u PCR tehnologiju, omogućavajući joj da otključa jedan smjer primjene za drugim, čineći detekciju nukleinskih kiselina praktičnijim i preciznijim.
Izvor: Dr. Yuan vas vodi na testiranje
Preporučeni proizvodi:
Vrijeme objave: 18.11.2022
