PCR je najraširenija tehnologija amplifikacije nukleinskih kiselina i široko se koristi zbog svoje osjetljivosti i specifičnosti.Međutim, PCR zahtijeva ponovnu termičku denaturaciju i ne može se riješiti ograničenja oslanjanja na instrumente i opremu, što ograničava njegovu primjenu u kliničkom testiranju na terenu.

Od ranih 1990-ih, mnoge laboratorije su počele razvijati tehnologiju pojačanja konstantne temperature koja ne zahtijeva termičku denaturaciju.Sada su razvili tehnologiju izotermne amplifikacije posredovane petljom, tehnologiju izotermne amplifikacije zamjene lanaca, tehnologiju izotermne amplifikacije kružnog toka i ovisnost o sekvenci nukleinske kiseline.Tehnologija izotermnog pojačanja i druge tehnologije. 

Loop posredovano izotermno pojačanje

Princip amplifikacije se zasniva na činjenici da je DNK u stanju dinamičke ravnoteže na oko 65°C.Kada je bilo koji prajmer uparen bazama i proširen na komplementarni dio dvolančane DNK, drugi lanac će se disocirati i postati jednolančan.

Na ovoj temperaturi, DNK koristi 4 specifična prajmera da se osloni na DNK polimerazu sa pomicanjem lanca kako bi sinteza DNK pomicanja lanca kontinuirano cirkulirala.

Prvo odredite 6 specifičnih regiona F3, F2, F1, B1, B2, B3 na ciljnom genu, a zatim dizajnirajte 4 prajmera na osnovu ovih 6 specifičnih regiona (kao što je prikazano na slici ispod):

Prednji unutrašnji prajmer (FIP) se sastoji od F1c i F2.

Povratni unutrašnji prajmer (BIP) se sastoji od B1c i B2, a TTTT se koristi kao odstojnik u sredini.

Spoljni prajmeri F3 i B3 se sastoje od regiona F3 i B3 na ciljnom genu.

U LAMP reakcijskom sistemu, koncentracija unutrašnjeg prajmera je nekoliko puta veća od spoljašnjeg prajmera.Unutrašnji prajmer se prvo kombinuje sa lancem šablona da bi se sintetizovao komplementarni lanac da bi se formirao dvostruki lanac DNK.Nakon toga, spoljašnji prajmer se kombinuje sa lancem šablona da bi se formirao dvostruki lanac DNK.Pod djelovanjem BstDNA polimeraze oslobađa se komplementarni lanac sintetiziran unutrašnjim prajmerom.Nakon niza reakcija, komplementarni lanac konačno formira jedan lanac DNK sa strukturom bučice.

Sama DNK strukture bučice se koristi kao šablon za kontinuirano formiranje DNK strukture prelazne petlje stabla sa otvorenim krajem.Unutrašnji i vanjski prajmeri vode DNK prijelazne strukture petlje stabljike da kontinuirano prolazi kroz reakcije pomicanja i produžetka lanca, te konačno formiraju višestruke strukture petlje stabla različitih dužina.DNK mješavina.

Prednosti i nedostaci izotermnog pojačanja posredovanog petljom

Prednosti LAMP-a:

(1) Visoka efikasnost amplifikacije, koja može efikasno amplificirati 1-10 kopija ciljnog gena u roku od 1h, a efikasnost amplifikacije je 10-100 puta veća od običnog PCR-a.

(2) Vrijeme reakcije je kratko, specifičnost je jaka i nije potrebna posebna oprema.

Nedostaci LAMP-a:

(1) Zahtjevi za prajmere su posebno visoki.

(2) Umnoženi proizvod ne može se koristiti za kloniranje i sekvenciranje, već se može koristiti samo za prosudbu.

(3) Zbog svoje jake osjetljivosti, lako se stvaraju aerosoli, uzrokujući lažne pozitivne rezultate i utičući na rezultate testa.

Strand displacement amplification

Amplifikacija pomicanja lanaca (SDA) je in vitro tehnika izotermne DNK amplifikacije zasnovana na enzimskoj reakciji koju je prvi predložio američki naučnik Walker 1992. godine.

Osnovni sistem SDA uključuje restrikcijsku endonukleazu, DNK polimerazu sa aktivnošću pomicanja lanaca, dva para prajmera, dNTP, te jone kalcija i magnezija i puferske sisteme.

Princip amplifikacije pomicanja lanca zasniva se na kemijski modificiranoj sekvenci prepoznavanja restrikcijske endonukleaze na oba kraja ciljne DNK.Endonukleaza otvara prazninu u lancu DNK na mjestu njegovog prepoznavanja, a DNK polimeraza proširuje prazninu 3′ End i zamjenjuje sljedeći lanac DNK.

Zamijenjeni pojedinačni lanci DNK mogu se kombinirati s prajmerima i proširiti u dvostruke lance pomoću DNK polimeraze.Ovaj proces se neprekidno ponavlja, tako da se ciljna sekvenca efikasno pojačava.

Prednosti i nedostaci tehnologije pojačanja pomaka pramena

Prednosti SDA:

Efikasnost amplifikacije je visoka, vrijeme reakcije je kratko, specifičnost je jaka i nije potrebna posebna oprema.

Nedostaci SDA:

Proizvodi nisu ujednačeni, a neki jednolančani i dvolančani proizvodi se uvijek proizvode u SDA ciklusu, a pri detekciji elektroforezom neizbježno će doći do osipanja.

Rolling krug pojačanje

Rolling circle amplification (RCA) se predlaže korištenjem metode kopiranja DNK iz patogenih organizama pomoću kotrljanja kruga.Odnosi se na upotrebu jednolančane kružne DNK kao šablona na konstantnoj temperaturi i posebne DNK polimeraze (kao što je Phi29) ) Pod djelovanjem kružne sinteze DNK kako bi se postigla amplifikacija ciljnog gena.

RCA se može podijeliti na linearno pojačanje i eksponencijalno pojačanje.Efikasnost linearnog RCA može doseći 10⁵puta, a efikasnost eksponencijalnog RCA može doseći 10⁹puta.

Jednostavna razlika, kao što je prikazano na donjoj slici, linearna amplifikacija a koristi samo 1 prajmer, eksponencijalna amplifikacija b ima 2 prajmera.

Linearni RCA se takođe naziva RCA sa jednim prajmerom.Prajmer se vezuje za kružnu DNK i produžava se djelovanjem DNK polimeraze.Proizvod je linearni pojedinačni lanac sa velikim brojem ponavljajućih sekvenci hiljadama puta dužine jedne petlje.

Budući da je proizvod linearnog RCA uvijek povezan sa početnim prajmerom, laka fiksacija signala je velika prednost.

Eksponencijalni RCA, također poznat kao Hyper razgranato pojačanje HRCA (Hyper razgranati RCA), u eksponencijalnom RCA, jedan prajmer pojačava RCA proizvod, drugi prajmer se hibridizira s RCA proizvodom i proširuje, a zamjena je već vezana za RCA proizvod.

Prednosti i nedostaci amplifikacije nukleinskih kiselina u krugu

Prednosti RCA:

Visoka osjetljivost, dobra specifičnost i jednostavan rad.

Nedostaci RCA:

Problemi u pozadini tokom detekcije signala.Tokom RCA reakcije, necirkulacijska sonda katanca i šablon DNK ili RNK nevezane sonde mogu generirati neke pozadinske signale. 

Namplifikacija zasnovana na sekvenci ukleinske kiseline

Amplifikacija bazirana na sekvenci nukleinske kiseline (NASBA) je nova tehnologija razvijena na bazi PCR.To je kontinuirana i izotermna amplifikacija nukleinske kiseline vođena parom prajmera sa T7 promotorskom sekvencom.Tehnologija može pojačati šablonsku RNK za oko 109 puta za oko 2 sata, što je 1000 puta više od konvencionalne PCR metode i ne zahtijeva posebnu opremu.

Ova tehnologija je korištena za brzu dijagnostiku bolesti čim su se pojavile, a mnoge kompanije trenutno koriste ovu metodu u kompletima za detekciju RNK.

Iako RNK amplifikacija može koristiti i PCR tehnologiju reverzne transkripcije, NASBA ima svoje prednosti: može se provesti pod relativno konstantnim temperaturnim uvjetima i stabilnija je i preciznija od tradicionalne PCR tehnologije.

Reakcija je na 41 stepen Celzijusa i za završetak je potrebna reverzna transkriptaza AMV (virus mijeloblastoze ptica), RNase H, T7 RNA polimeraza i par prajmera.

Proces uglavnom uključuje:

Prednji prajmer sadrži komplementarnu sekvencu T7 promotora.Tokom reakcije, prednji prajmer se vezuje za RNA lanac i katalizira ga enzim AMV da bi se formirao dvostruki lanac DNK-RNA.

RNaza H razgrađuje RNK u hibridnom dvolančanom i zadržava jednolančanu DNK.

Pod dejstvom reverznog prajmera i enzima AMV formira se dvostruki lanac DNK koji sadrži sekvencu promotora T7.

Pod dejstvom T7 RNA polimeraze, proces transkripcije se završava i stvara se velika količina ciljne RNK.

Prednosti NASBA:

(1) Njegov prajmer ima T7 promotorsku sekvencu, ali strana dvolančana DNK nema sekvencu T7 promotora i ne može se pojačati, tako da ova tehnologija ima visoku specifičnost i osjetljivost.

(2) NASBA direktno uključuje proces reverzne transkripcije u reakciju amplifikacije, skraćujući vrijeme reakcije.

Nedostaci NASBA:

(1) Komponente reakcije su složenije.

(2) Potrebne su tri vrste enzima da bi cijena reakcije bila veća.