Ct vrijednost je najvažniji oblik prezentacije rezultata fluorescentnog kvantitativnog PCR-a.Koristi se za izračunavanje razlika u ekspresiji gena ili broja kopija gena.Dakle, koja se vrijednost Ct kvantifikacije fluorescencije smatra razumnom?Kako osigurati efektivni raspon vrijednosti Ct?
Šta je Ct vrijednost?
Tokom procesa qPCR amplifikacije, odgovarajući broj ciklusa amplifikacije (Cycle Threshold) kada signal fluorescencije pojačanog proizvoda dostigne postavljeni prag fluorescencije.C označava ciklus, a T označava prag.Jednostavno rečeno, vrijednost Ct je broj ciklusa koji odgovara trenutku kada početna amplifikacija šablona dostigne određenu količinu proizvoda u qPCR-u.Takozvana “određena količina proizvoda” će biti dodatno objašnjena kasnije.
Šta radi Ct vrijednost?
1. Odnos između eksponencijalnog pojačanja, količine šablona i Ct vrijednosti
U idealnom slučaju, geni u qPCR-u se akumuliraju eksponencijalnom amplifikacijom nakon određenog broja ciklusa.Odnos između broja ciklusa pojačanja i količine proizvoda je: Količina pojačanog proizvoda = početni iznos šablona × (1+En) broj ciklusa.Međutim, qPCR reakcija nije uvijek u idealnoj situaciji.Kada količina pojačanog proizvoda dostigne "određenu količinu proizvoda", broj ciklusa u ovom trenutku je Ct vrijednost i nalazi se u eksponencijalnom periodu pojačanja.Odnos između Ct vrijednosti i količine početnog predloška: Postoji linearni odnos između Ct vrijednosti predloška i logaritma početnog broja kopije šablona.Što je veća početna koncentracija šablona, to je manja vrijednost Ct;što je niža početna koncentracija šablona, veća je vrijednost Ct.
2. Kriva amplifikacije, prag fluorescencije i određena količina PCR proizvoda
Količina proizvoda qPCR amplifikacije je direktno predstavljena u obliku fluorescentnog signala, odnosno krive amplifikacije.U ranoj fazi PCR-a, amplifikacija je u idealnim uslovima, broj ciklusa je mali, akumulacija proizvoda je mala, a nivo fluorescencije se ne može jasno razlikovati od pozadine fluorescencije.Nakon toga, fluorescencija se povećava i ulazi u eksponencijalnu fazu.Količina PCR proizvoda može se otkriti u određenom trenutku kada je PCR reakcija samo u eksponencijalnoj fazi, što se može koristiti kao „određena količina proizvoda“, a iz toga se može zaključiti početni sadržaj šablona.Prema tome, intenzitet signala fluorescencije koji odgovara određenoj količini proizvoda je prag fluorescencije.
U kasnoj fazi PCR-a, kriva amplifikacije više ne pokazuje eksponencijalno pojačanje, već ulazi u linearnu fazu i fazu platoa.
3. Reproducibilnost Ct vrijednosti
Kada PCR ciklus dostigne broj ciklusa vrijednosti Ct, upravo je ušao u pravi period eksponencijalne amplifikacije.U ovom trenutku, mala greška nije pojačana, tako da je ponovljivost vrijednosti Ct odlična, odnosno isti šablon se pojačava u različito vrijeme ili u različitim epruvetama u isto vrijeme.Pojačavanjem, dobijena vrijednost Ct je konstantna.
1. Efikasnost pojačanja En
Efikasnost PCR amplifikacije odnosi se na efikasnost kojom polimeraza pretvara gen koji treba amplificirati u amplikon.Efikasnost amplifikacije kada se jedan molekul DNK transformiše u dva molekula DNK je 100%.Efikasnost amplifikacije se obično izražava kao En.Kako bi se olakšala analiza narednih članaka, ukratko su predstavljeni faktori koji utiču na efikasnost amplifikacije.
| Faktori uticaja | objašnjenje | Kako suditi? |
| A. PCR inhibitori | 1. DNK šablona sadrži supstance koje inhibiraju PCR reakciju, kao što su proteini ili deterdženti.2. cDNK nakon reverzne transkripcije sadrži visoku koncentraciju šablonske RNK ili komponenti RT reagensa, koji također mogu inhibirati naknadnu PCR reakciju. | 1. Da li postoji zagađenje može se procijeniti mjerenjem omjera A260/A280 i A260/A230 ili RNA elektroforezom.2. Da li je cDNK razrijeđena u određenom omjeru nakon reverzne transkripcije. |
| B. Nepravilan dizajn prajmera | Prajmeri se ne žare efikasno | Provjerite ima li prajmer-dimera ili ukosnica, neusklađenosti, a ponekad i introničkih dizajna. |
| C. Nepravilan dizajn programa PCR reakcije | 1. Prajmeri ne mogu efikasno žariti2. Nedovoljno oslobađanje DNK polimeraze 3. Dugotrajna visokotemperaturna aktivnost DNK polimeraze smanjena | 1. Temperatura žarenja je viša od TM vrijednosti prajmera2. Vrijeme preddenaturacije je prekratko 3. Vrijeme svake faze reakcije je predugo |
| D. Nedovoljno miješanje reagensa ili greške u pipetiranju | U reakcionom sistemu, lokalna koncentracija komponenti PCR reakcije je previsoka ili neujednačena, što dovodi do neeksponencijalnog pojačanja PCR amplifikacije | |
| E. Dužina amplikona | Dužina amplikona je predugačka, prelazi 300bp, a efikasnost amplifikacije je niska | Proverite da li je dužina amplikona između 80-300bp |
| F. Utjecaj qPCR reagensa | Koncentracija DNK polimeraze u reagensu je niska ili koncentracija iona u puferu nije optimizirana, što rezultira time da aktivnost Taq enzima ne dostiže maksimum | Određivanje efikasnosti pojačanja standardnom krivom |
2. Raspon Ct vrijednosti
Ct vrijednosti se kreću od 15-35.Ako je vrijednost Ct manja od 15, smatra se da je pojačanje unutar raspona baznog perioda i da prag fluorescencije nije dostignut.U idealnom slučaju, postoji linearna veza između vrijednosti Ct i logaritma početnog broja kopije šablona, odnosno standardne krive.Kroz standardnu krivu, kada je efikasnost amplifikacije 100%, izračunata vrijednost Ct za kvantifikaciju broja pojedinačne kopije gena je oko 35. Ako je veći od 35, početni broj kopija šablona je teoretski manji od 1, što se može smatrati besmislenim.
Za različite Ct opsege gena, zbog razlike u broju kopija gena i efikasnosti amplifikacije u početnoj količini šablona, potrebno je napraviti standardnu krivu za gen i izračunati linearni opseg detekcije gena.
3. Faktori utjecaja na vrijednost Ct
Iz odnosa između broja ciklusa amplifikacije i količine proizvoda: količina pojačanog proizvoda = količina početnog šablona × (1+En) broj ciklusa, može se vidjeti da će u idealnim uvjetima količina početnog šablona i En imati negativan utjecaj na vrijednost Ct.Razlika u kvalitetu šablona ili efikasnosti pojačanja će uzrokovati da vrijednost Ct bude prevelika ili premala.
4.Ct vrijednost je prevelika ili premala
Vrijeme objave: Feb-22-2023
