Gubitak sluha (HL) je najčešća bolest senzornog invaliditeta kod ljudi.U razvijenim zemljama, oko 80% slučajeva predlingvalne gluvoće kod djece uzrokovano je genetskim faktorima.Najčešći su defekti jednog gena (kao što je prikazano na slici 1), utvrđeno je da su 124 genske mutacije povezane sa nesindromskim gubitkom sluha kod ljudi, a ostale su uzrokovane faktorima okoline.Kohlearni implantat (elektronski uređaj postavljen u unutrašnje uho koji pruža električnu stimulaciju direktno slušnom živcu) je daleko najefikasnija opcija za liječenje teške HL, dok slušni aparat (spoljni elektronski uređaj koji pretvara i pojačava zvučne valove) može pomoći pacijentima s umjerenim HL.Međutim, trenutno nema dostupnih lijekova za liječenje nasljednog HL (GHL).Posljednjih godina, genska terapija dobija sve veću pažnju kao obećavajući pristup u liječenju disfunkcije unutrašnjeg uha.

Fig1.Distribucija tipa varijacije povezane s gluhoćom.[1]

Nedavno su naučnici sa Instituta Salk i Univerziteta u Sheffieldu objavili rezultate istraživanja u Molekularnoj terapiji – Metode i klinički razvoj [2], koji su pokazali široke izglede za primjenu in vivo genske terapije nasljedne gluvoće.Uri Manor, docent istraživač na Salk institutu i direktor Waitt centra za naprednu biofotoniku, rekao je da je rođen sa teškim gubitkom sluha i smatra da bi vraćanje sluha bilo divan dar.Njegovo prethodno istraživanje je pokazalo da je Eps8 regulatorni protein aktina sa aktivnostima vezanja i zatvaranja aktina;u ćelijama kohlearne dlake, proteinski kompleks koji formira Eps8 sa MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 i GNAI3 uglavnom postoji u većini. Vrhovi dugih stereocilija, koji zajedno sa MYO15A lokalizuju BAIAP2L2 na vrhovima kraćih stereocilija, potrebni su za održavanje snopova kose.Stoga, Eps8 može regulisati dužinu stereocilija ćelija kose, što je neophodno za normalnu funkciju sluha;Brisanje ili mutacija Eps8 dovest će do kratkih stereocilija, zbog kojih ne može pravilno pretvoriti zvuk u električne signale za percepciju mozga, što zauzvrat dovodi do gluvoće..Istovremeno, saradnik Walter Marcotti, profesor na Univerzitetu Sheffield, otkrio je da ćelije kose ne mogu normalno da se razvijaju u nedostatku Eps8.U ovoj studiji, Manor i Marcotti udružili su se kako bi istražili može li dodavanje Eps8 stereocilijarnim stanicama vratiti njihovu funkciju i, zauzvrat, poboljšati sluh kod miševa.Istraživački tim je koristio vektor za adeno-asociran virus (AAV) Anc80L65 da isporuči kodirajuću sekvencu koja sadrži divlji tip EPS8 u pužnicu Eps8-/- novorođenih P1-P2 miševa injekcijom membrane u obliku okruglog prozora;u ćelijama kohlearne dlake miša Funkcija stereocilija je popravljena prije nego što su sazrele;a efekat popravke karakterizirala je tehnologija snimanja i mjerenje stereocilija.Rezultati su pokazali da Eps8 povećava dužinu stereocilija i obnavlja funkciju ćelija dlake u ćelijama niske frekvencije.Također su otkrili da su s vremenom stanice izgubile sposobnost da budu spašene ovom genskom terapijom.Implikacija je da će se ovaj tretman možda morati primijeniti in utero, jer su Eps8-/- ćelije dlake možda sazrele ili akumulirale oštećenje koje se ne može popraviti nakon što su miševi rođeni.“Eps8 je protein s mnogo različitih funkcija, a ima još mnogo toga za istražiti,” rekao je Manor.Buduća istraživanja će uključivati ​​istraživanje efekta Eps8 genske terapije u obnavljanju sluha u različitim razvojnim fazama, te da li je moguće produžiti mogućnosti liječenja.Slučajno, u novembru 2020., profesor KarenB Avraham sa Univerziteta u Tel Avivu u Izraelu objavio je svoje rezultate u časopisu EMBO Molecular Medicine [3], koristeći inovativnu tehnologiju genske terapije za stvaranje bezopasnog sintetičkog adeno-povezanog virusa AAV9-PHP.B, Defekt gena u ćelijama dlake Syne4-/- miševa je popravljen ubrizgavanjem virusa koji nosi kodirajuću sekvencu Syne4 u unutrašnje uho miševa, omogućavajući mu da uđe u ćelije dlake i oslobodi preneseni genetski materijal, omogućavajući im da sazriju i normalno funkcionišu (kao na slici 2).

Fig2.Šematski prikaz anatomije unutrašnjeg uha, sa fokusom na Cortijev organ i ćelijsku funkciju nesprina-4.

Vidi se da upotreba genske terapije za postizanje svrhe liječenja nasljednih bolesti na nivou gena umetanjem, uklanjanjem ili ispravljanjem mutiranih gena za liječenje (odnosno, kontrola genetskih promjena u bolesti) ima visok klinički učinak.izgledi za primjenu.Trenutne metode genske terapije za genetski deficitarnu gluvoću mogu se podijeliti u sljedeće kategorije:

zamjena gena

Zamjena gena je vjerojatno najjednostavniji oblik genske terapije, zasnovan na identifikaciji i zamjeni defektnog gena normalnom ili divljom kopijom gena.Prva uspješna studija genske terapije unutrašnjeg uha za gubitak sluha uzrokovan delecijom gena vezikularnog transportera glutamata 3 (VGLUT3);AAV1 posredovana isporuka egzogene prekomerne ekspresije VGLUT3 u ćelijama dlake unutrašnjeg uha (IHCs) može dovesti do trajnog oporavka sluha, delimičnog oporavka sinaptičke morfologije trake i konvulzivnih odgovora [4].Međutim, u primjerima koji uključuju dvije zamjene gena koje je isporučila AAV opisana u uvodu iznad, važno je napomenuti da su modeli miša koji se koriste za određene vrste nasljednih poremećaja gubitka sluha s delecijom gena vremenski različiti od ljudi, a kod P1 miševa, unutrašnje uho je u zreloj fazi razvoja.Nasuprot tome, ljudi se rađaju sa zrelim unutrašnjim uhom.Ova razlika sprječava moguću primjenu rezultata miša u liječenju nasljednih poremećaja gluvoće kod ljudi osim ako se genska terapija ne primjenjuje na zrele mišje uši.

Uređivanje gena: CRISPR/Cas9

U poređenju sa „zamjenom gena“, razvoj tehnologije za uređivanje gena doveo je do početka liječenja genetskih bolesti iz korijena.Važno je da metoda uređivanja gena nadoknađuje nedostatke tradicionalnih metoda genske terapije prekomjerne ekspresije koje nisu prikladne za dominantne nasljedne bolesti gluvoće, te problem što metoda prekomjerne ekspresije ne traje dugo.Nakon što su kineski istraživači specifično nokautirali mutantni alel Myo6C442Y kod Myo6WT/C442Y miševa koristeći sistem za uređivanje gena AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2, iu roku od 5 mjeseci od nokauta, miševi, slušna funkcija modela je obnovljena;istovremeno je uočeno da se poboljšala stopa preživljavanja ćelija dlake u unutrašnjem uhu, oblik cilija je postao pravilan, a elektrofiziološki indikatori su korigovani [5].Ovo je prva studija u svijetu koja koristi CRISPR/Cas9 tehnologiju za liječenje nasljedne gluvoće uzrokovane mutacijom gena Myo6 i važan je istraživački napredak tehnologije za uređivanje gena za liječenje nasljedne gluvoće.Klinički prijevod liječenja pruža solidnu naučnu osnovu.

Metode isporuke genske terapije

Da bi genska terapija bila uspješna, goli molekuli DNK ne mogu efikasno prodrijeti u ćelije zbog svoje hidrofilnosti i negativnog naboja fosfatnih grupa, a kako bi se osigurao integritet suplementiranih molekula nukleinske kiseline, mora se odabrati sigurna i učinkovita metoda.Dopunjena DNK se isporučuje u ciljnu ćeliju ili tkivo.AAV se široko koristi kao sredstvo za isporuku za liječenje bolesti zbog svog visokog infektivnog učinka, niske imunogenosti i širokog tropizma na različite tipove tkiva.Trenutno je veliki broj istraživačkih radova utvrdio tropizam različitih podtipova AAV u odnosu na različite tipove ćelija u pužnici miša.Korištenjem karakteristika AAV isporuke u kombinaciji sa promotorima specifičnim za ćeliju može se postići ćelijsko specifična ekspresija, što može smanjiti efekte izvan cilja.Osim toga, kao alternativa tradicionalnim AAV vektorima, novi sintetički AAV vektori se stalno razvijaju i pokazuju superiornu sposobnost transdukcije u unutrašnjem uhu, od kojih je AAV2/Anc80L65 najčešće korišten.Metode nevirusne isporuke mogu se dalje podijeliti na fizičke metode (mikroinjekcija i elektroporacija) i kemijske metode (na bazi lipida, na bazi polimera i nanočestica zlata).Oba pristupa su korištena u liječenju nasljednih poremećaja gluvoće i pokazala su različite prednosti i ograničenja.Pored nosača za gensku terapiju kao nosača, mogu se koristiti različiti pristupi za in vivo davanje gena na osnovu različitih tipova ciljnih ćelija, puteva davanja i terapijske efikasnosti.Zamršena struktura unutrašnjeg uha otežava dolazak do ciljnih ćelija, a distribucija agenasa za uređivanje genoma je spora.Membranasti labirint se nalazi unutar koštanog lavirinta temporalne kosti i uključuje kohlearni kanal, polukružni kanal, utrikulu i balon.Njegova relativna izolacija, minimalna limfna cirkulacija i odvojenost od krvi barijerom krvnog lavirinta ograničavaju efektivnu sistemsku isporuku terapeutika samo novorođenčadskim miševima.Da bi se dobili virusni titri pogodni za gensku terapiju, neophodna je direktna lokalna injekcija virusnih vektora u unutrašnje uho.Uspostavljeni putevi ubrizgavanja uključuju [6]: (1) membranu okruglog prozora (RWM), (2) traheostomiju, (3) endolimfatičnu ili perilimfatičnu kohleostomiju, (4) membranu sa okruglim prozorom plus fenestraciju cijevi (CF) (kao na slici 3).

Fig3.Isporuka genske terapije u unutrašnje uho.

Iako je postignuto mnogo napretka u genskoj terapiji, zasnovano na kliničkim translacijskim ciljevima, potrebno je još raditi prije nego što genska terapija postane opcija liječenja prve linije za pacijente s genetskim bolestima, posebno u razvoju sigurnih i učinkovitih vektora i metoda isporuke.Ali vjerujemo da će u bliskoj budućnosti ove vrste tretmana postati osnovni dio personalizirane terapije i da će imati izuzetno pozitivan utjecaj na živote ljudi s genetskim poremećajima i njihovih porodica.

Foregene je također lansirao komplet za skrining visoke propusnosti za ciljane gene, koji je brz i može izvesti reverznu transkripciju i qPCR reakcije bez ekstrakcije RNK.

Linkovi proizvoda

Cell Direct RT-qPCR komplet—Taqman/SYBR GREEN I

Za više informacija o proizvodu kontaktirajte:

overseas@foregene.com