Izvanredna karakteristika PCR reakcije je njen veliki kapacitet amplifikacije i izuzetno visoka osjetljivost.Kako bismo poboljšali performanse PCR-a i efikasnost detekcije, posvećeni smo poboljšanju kapaciteta PCR amplifikacije i osjetljivosti detekcije, ali glavobolja je u procesu eksperimenta.Često se javljaju lažno pozitivni rezultati, a vrlo mala količina unakrsne kontaminacije uzorka ili kontaminacije PCR proizvoda može uzrokovati lažno pozitivne rezultate u eksperimentu.
Pet vrsta kontaminacije PCR proizvoda
Postoji mnogo razloga za PCR kontaminaciju, koji se grubo mogu podijeliti u sljedeće kategorije:
Kontaminacija uzorka je uglavnom uzrokovana kontaminacijom posude za prikupljanje uzorka, ili kada se uzorak stavi, iscuri iz spremnika zbog labavog zatvaranja, ili je uzorak zalijepljen za vanjsku stranu posude, što uzrokuje unakrsnu kontaminaciju;Kontaminacija dovodi do kontaminacije između uzoraka;neki mikrobiološki uzorci, posebno virusi, mogu se širiti aerosolima ili formirati aerosole, što rezultira međusobnom kontaminacijom.
Glavni razlog je to što su tokom pripreme PCR reagensa pištolj za uzorke, kontejner, dvostruko destilovana voda i drugi rastvori kontaminirani šablonom nukleinske kiseline za PCR.
U laboratorijama molekularne biologije i nekim laboratorijama koje koriste klonirane plazmide kao pozitivne kontrole, problem kontaminacije kloniranim plazmidom je također čest.Budući da je sadržaj klonirajućeg plazmida u jediničnoj zapremini prilično visok, te je potrebno više alata i reagensa u procesu pročišćavanja, a velika je vjerovatnoća da će plazmid u živim stanicama biti kontaminiran zbog snažnog rasta i sposobnosti reprodukcije živih stanica.
Kontaminacija amplificiranih proizvoda je najčešći problem kontaminacije u PCR reakcijama.Budući da je količina kopija PCR proizvoda velika (uglavnom 1013 kopija/ml), što je daleko više od granice broja kopija za detekciju PCR-a, vrlo mala količina kontaminacije PCR proizvoda može uzrokovati lažno pozitivne rezultate.
Zagađenje aerosolom je najvjerovatniji oblik kontaminacije PCR proizvoda, a ujedno ga je i najlakše previdjeti.Nastaje trenjem između površine tekućine i zraka.Općenito, aerosolna kontaminacija može nastati kada se otvori poklopac, kada se uzorak usisava ili čak kada se reakciona epruveta snažno protrese.Prema proračunima, čestica aerosola može sadržavati 48.000 primjeraka, pa je zagađenje koje njome uzrokuje predstavlja problem koji zaslužuje posebnu pažnju.
Konkretno, laboratorije za testiranje često koriste isti par prajmera za testiranje određenog gena.Vremenom će u laboratorijskom prostoru doći do velike količine kontaminacije PCR proizvoda.Jednom kada dođe do takve kontaminacije, teško ju je eliminirati u kratkom vremenu.
Za prve tri vrste zagađenja možemo koristiti efikasna sredstva za izbjegavanje, ali je zagađenje uzrokovano PCR proizvodima teško spriječiti, posebno u izgradnji nestandardnih PCR laboratorija.U PCR procesu, kada vrh pipete usisava i ispuhuje tečnost, a poklopac PCR epruvete se otvori, formiraće se aerosol.Molekule DNK koje nosi aerosol (jedan aerosol može nositi desetine hiljada DNK) teško je eliminirati jer lebde u zraku.Kada se uvede sljedeća runda PCR eksperimenata, neizbježno će doći do lažnih pozitivnih rezultata.
Kao što je prikazano na donjoj slici, negativna kontrola je također pojačala odgovarajući opseg od interesa:
Ovdje je predstavljen prvi dio ovog pitanja PCR zagađenja i prevencije.Sljedeće izdanje donosi vam drugi dio "Prevencija kontaminacije PCR proizvodima", stoga ostanite sa nama!
Vrijeme objave: Jul-25-2017
