Vjerujem da će se svi uvijek susresti sa ovakvim ili ovakvim problemima kada rade PCR reakcije, ali većinu njih možemo svrstati u dva glavna problema:

Premalo amplifikacije genskog šablona (amplifikacija);
Previše neciljanog pojačanja gena.
Upotreba aditiva je jedna od uobičajenih strategija za rješavanje ovih problema.Obično uloga aditiva ima dva aspekta:
sekundarna strukturagena (sekundarna struktura);
Smanjite nespecifično prajming.
Danas će vam urednik ukratko predstaviti uobičajene aditive u PCR reakcijama i njihove funkcije.
Aditivi koji smanjuju sekundarnu strukturu
sulfoksid(DMSO)
uzorci genasa visokim sadržajem GC.Međutim, DMSO također uvelike smanjuje aktivnost Taq polimeraze.Stoga svi moraju uravnotežiti dostupnost šablona i aktivnost polimeraze.Urednik predlaže da možete isprobati različite koncentracije DSMO-a, kao što je od 2% do 10%, kako biste pronašli koncentraciju koja odgovara vašem eksperimentu.
Nejonski deterdženti
Nejonski deterdženti, kao što su 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 ili NP-40, obično smanjuju sekundarnu strukturu DNK.Iako ovo može povećati amplifikaciju šablonskog gena, također će uzrokovati probleme nespecifične amplifikacije.Dakle, ovi aditivi dobro rade za PCR reakcije niskog prinosa bez ostataka, ali ne tako dobro za relativno nečiste PRC reakcije.Još jedna prednost nejonskih deterdženata je smanjenje kontaminacije SDS-om.Obično tokom procesa ekstrakcije DNK, SDS će biti doveden u PCR korak, koji u velikoj mjeri inhibira aktivnost polimeraze.Stoga, dodavanje 0,5% Tween-20 ili Tween-40 u reakciju može neutralizirati negativne efekte SDS.
Betain_
Betain može poboljšati amplifikaciju DNK smanjenjem formiranja sekundarne strukture i općenito je "misteriozni" dodatak komercijalnim PCR setovima.Ako želite koristiti betain, treba staviti betain ili betain monohidrat (Betaine ili Betaine mono-hidrat), ali ne i betain hidroklorid (Betaine HCl), podesiti na konačnu koncentraciju od 1-1,7M.Betain takođe može pomoći u poboljšanju specifičnosti jer eliminiše zavisnost od sastava para baza o taljenju DNK/denaturaciji DNK.
Aditivi za smanjenje nespecifičnog prajminga
Formamid
Formamid je uobičajeni organski PCR aditiv.Može se kombinovati sa glavnim i manjim žlebom u DNK, čime se smanjuje stabilnost dvostruke spirale glavne DNK i snižava temperatura topljenja DNK.Koncentracija formamida koji se koristi u PCR eksperimentima je obično 1%-5%.
Tetrametilamonijum hlorid( TMAC)
Tetrametilamonijum hlorid može povećati specifičnost hibridizacije (specifičnost hibridizacije) i povećati temperaturu topljenja DNK.Dakle, TMAC može ukloniti nespecifično prajming i smanjiti pogrešno vezivanje DNK i RNK.Ako koristitedegenerisani prajmeriu PCR reakciji, ne zaboravite dodati TMAC, koji se obično koristi u koncentraciji od 15-100 mM.
Ostali uobičajeni aditivi
Pored dvije gore navedene kategorije aditiva, postoji mnogo uobičajenih aditiva u PCR reakcijama, iako imaju različite funkcije, također su vrlo važni.
Magnezijum jon
Magnezijum jon je neizostavan kofaktor (kofaktor) polimeraze, odnosno bez jona magnezijuma polimeraza je neaktivna.Međutim, previše jona magnezijuma takođe može uticati na efikasnost polimeraze.Koncentracija magnezijevih jona u svakoj PCR reakciji će varirati.Kelatni agensi (kao što su EDTA ili citrat), koncentracija dNTP i proteina utiču na koncentraciju jona magnezijuma.Dakle, ako imate problema sa svojim PCR eksperimentom, možete pokušati promijeniti različite koncentracije magnezijevih jona, na primjer, od 1,0 do 4,0 mM, s intervalom od 0,5 do 1 mM između.
Vrijedi napomenuti da višestruki ciklusi zamrzavanja-odmrzavanja mogu dovesti do stratifikacije koncentracije otopine magnezijum hlorida.Stoga ga morate potpuno otopiti prije svake upotrebe i dobro promiješati prije upotrebe.
Goveđi serum albumin(goveđi albumin, BSA)
U eksperimentima molekularne hemije, goveđi serumski albumin je vrlo čest aditiv, posebno u probavi restrikcijskim enzimima i PCR eksperimentima.U PCR reakcijama, BSA pomaže u smanjenju kontaminanata kao što su fenolna jedinjenja.Takođe se kaže da može smanjiti prianjanje reaktanata na zid epruvete.U PCR reakciji, obično koncentracija dodanog BSA može doseći 0,8 mg/ml.
 
Srodni proizvodi:
PCR Hero(sa bojom)
PCR Hero