Verifikacija performansi prajmera i sondi u ranoj fazi PCR reagenasa i određivanje najpogodnijih uslova reakcije su preduslovi da se obezbedi nesmetan napredak formalnih eksperimenata.
Dakle, kako trebamo potvrditi prajmer sondu u ranoj fazi?
Glavni indikatori su osnovna linija, kriva amplifikacije, ct vrijednost, efikasnost amplifikacije, detekcija uzoraka niske koncentracije, CV, itd.
Osnovna linija
Osnovna linija je horizontalna linija u krivulji PCR amplifikacije.U prvih nekoliko ciklusa reakcije PCR amplifikacije, signal fluorescencije se ne mijenja mnogo i formira pravu liniju.Ova ravna linija je osnovna linija.
Prilikom skrininga PCR prajmer sondi, obratite pažnju na to da li je osnovna linija ravna.Čistoća koncentracije prajmer sonde će uticati na osnovnu liniju, kao što je uzrok porasta ili pada osnovne linije.Osnovna linija je takođe vrlo intuitivan indikator.
Amplification Curve
Drugi intuitivan indikator je oblik krivulje pojačanja.Najbolje je imati krivulju u obliku slova S kako bi se izbjeglo sekundarno pojačanje ili druge abnormalne krivulje pojačanja.
Ct vrijednost
Broj ciklusa koji odgovara tački pregiba od osnovne linije do eksponencijalnog rasta je Ct vrijednost.
Za isti uzorak, različite prajmer sonde rezultiraju različitim krivuljama pojačanja, a na odgovarajuću Ct vrijednost će uticati efikasnost amplifikacije i stepen interferencije.U teoriji, što je manja vrijednost Ct prajmer sonde koju odaberemo, to bolje.
Efikasnost pojačanja
Jedna od najpouzdanijih i najstabilnijih metoda za procjenu efikasnosti PCR amplifikacije je standardna kriva, koja je također široko priznata od strane istraživača.Metoda uključuje izradu serije uzoraka za kontrolu relativnog broja ciljnih šablona.Ovi uzorci se obično prave serijskim razrjeđivanjem koncentriranih osnovnih otopina, a najčešće se koristi 10-struko razrjeđivanje.Koristeći seriju razrijeđenih uzoraka, koristeći standardni qPCR program za amplifikaciju da biste dobili vrijednost Cq, i na kraju nacrtajte standardnu krivu prema koncentraciji svakog uzorka i odgovarajuću vrijednost Cq da biste dobili linearnu jednačinu Cq= -klgX0+b, i efikasnost amplifikacije E=10(-1 /k)-1.Kada se koristi qPCR za kvantitativnu analizu, potrebno je da efikasnost amplifikacije bude u rasponu od 90%-110% (3,6>k>3,1).
Detekcija uzoraka niske koncentracije
Kada je koncentracija uzorka niska, stope detekcije različitih prajmer sondi su različite.Odabrali smo 20 uzoraka niske koncentracije za repliciranje, a sistem prajmer-sonda sa najvećom stopom detekcije je najbolji.
Koeficijent varijacije (CV)
10 duplikata uzoraka može se detektovati različitim prajmer sondama u skladu sa linijskim standardom reagensa za detekciju amplifikacije nukleinske kiseline.
Kvantitativni reagensi:
Preciznost
Tačnost unutar jedne serije treba da zadovolji: koeficijent varijacije (CV,%) logaritamske vrijednosti ispitne koncentracije je ≤5%.Kada je koncentracija uzorka niska, koeficijent varijacije (CV,%) logaritma koncentracije detekcije je ≤10%
Kvalitativni reagensi:
Preciznost
Tačnost unutar jedne serije treba da zadovolji:
(1) Koeficijent varijacije vrijednosti Ct (CV,%) ≤5%
Isti uzorak se testira paralelno 10 puta, a rezultati ispitivanja trebaju biti konzistentni
Vrijeme objave: Sep-18-2021
