Autori: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Jedinica: bolnica Jiaozhou, bolnica Dongfang pridružena Univerzitetu Tongji

Trenutno, glavni tip uzorka za detekciju nukleinske kiseline respiratornog patogena je bris grla.Postoji mnogo vrsta najčešće korištenih rješenja za očuvanje uzoraka, od kojih se sve moraju hladiti ili zamrznuti radi transporta i skladištenja;Teško je kontrolisati ceo proces niske temperature tokom procesa sakupljanja i transporta, a teško je obezbediti kontrolu kvaliteta pre ispitivanja uzorka.^[1-2].

RNaza (RNase) je endonukleaza koja hidrolizira RNK, uglavnom prekidajući fosfodiestarske veze između nukleotida.Molekul RNaze je vrlo stabilan, u strukturi postoje disulfidne veze, a za njegovu aktivnost nije potrebno prisustvo dvovalentnih katjona, pa se RNaza ne denaturira lako, a lako se renaturira čak i nakon visoke temperature ili upotrebe denaturansa.RNaze se dijele na endogene i egzogene.Endogene RNaze se mogu osloboditi u isto vrijeme kada su ćelije rupturirane.Stoga je eliminacija uloge endogenih RNaza vrlo kritičan korak u procesu ekstrakcije RNK.Egzogene RNaze su široko rasprostranjene.RNaze postoje u vazduhu, ljudskoj koži, kosi i pljuvački, što su važni razlozi za laku razgradnju RNK^[3].

Upit podataka

CANS-CL02-A009 “Primjena smjernica za kvalitet i kompetenciju medicinskih laboratorija u oblasti molekularne dijagnoze” u tehničkim zahtjevima predlaže da se formulišu odgovarajući standardi kvaliteta vode u skladu sa aplikacijom;Nepropusni kontejneri za jednokratnu upotrebu:

RNase/Klasifikacija

(1) RNaza A

Ribonukleaza A (RNase A), izvedena iz goveđeg pankreasa, je endoribonukleaza koja može specifično napasti 3′ kraj ostataka pirimidina na RNK, rezajući citozin ili uracil formiran od susjednih nukleotida.Fosfodiesterska veza, konačni proizvod reakcije je 3' pirimidin nukleotid i oligonukleotid sa 3' pirimidin nukleotidom na kraju.

(2) RNaza T1

Ribonukleaza T1 (RNase T1) je izvedena iz Aspergillus orjzae, specifično djeluje na 3′-terminalni fosfat gvanina, a mjesto cijepanja je između 3′ fosfata gvanina i 5′ hidroksila susjednog nukleotia.Konačni proizvod reakcije je 3′gvanilna kiselina i fragmenti oligonukleotida sa 3′gvanilnom kiselinom na kraju.

(3) RNaza H

Ribonukleaza H (RNase H) je prvi put otkrivena iz tkiva timusa teleta, a njen kodirajući gen je kloniran u Escherichia coli.Može specifično razgraditi DNK: RNK lanci u RNA hibridnim dupleksima, što rezultira oligonukleotidima i mononukleotidima sa 3′-OH i 5′-monofosfatnim krajevima, ne može razgraditi jednolančanu ili dvolančanu DNK ili RNK.

RNase

Funkcija i upotreba

Ribonukleaza može katalizirati razgradnju ribonukleinske kiseline (RNA) i može se sintetizirati umjetno.Medicinska mast se koristi lokalno za liječenje trauma i bolova u zglobovima.Prema izvještajima, ribonukleaza može promijeniti metabolizam ćelije domaćina, inhibirati sintezu virusa, inhibirati proliferaciju virusa gripe in vitro i inhibirati stvaranje vakcinije i herpes virusa u pilećim embrionima.Klinička upotreba ribonukleaze dnevne intramuskularne injekcije od 180 mg, korisna za liječenje epidemijskog encefalitisa, ribonukleaza može katalizirati razgradnju ribonukleinske kiseline (RNA) i sada se može umjetno sintetizirati.Medicinska mast se koristi lokalno za liječenje trauma i bolova u zglobovima.Prema izvještajima, ribonukleaza može promijeniti metabolizam ćelije domaćina, inhibirati sintezu virusa, inhibirati proliferaciju virusa gripe in vitro i inhibirati stvaranje vakcinije i herpes virusa u pilećim embrionima.Klinička upotreba ribonukleaze dnevne intramuskularne injekcije od 180 mg je korisna za liječenje epidemijskog encefalitisa.

RNase

Definicija inhibitora

Definicija jedinice inhibitora RNaze: Količina enzima potrebna za inhibiciju 50% aktivnosti 5ng RNaze A je jedna jedinica.

Kako rade inhibitori RNase

Gvanidin izotiocijanat:

Gvanidin izotiocijanat je organsko jedinjenje sa molekulskom formulom C2H6N4S.Uglavnom se koristi u biološkoj medicini, hemijskim reagensima itd. Gvanidin izotiocijanat je sredstvo za lizu proteina, a često se koristi kao glavna komponenta rastvora za lizu u molekularnim dijagnostičkim reagensima.Može lizirati tkivo, uništiti ćelijsku strukturu i disociirati nukleinsku kiselinu od nukleoproteina i ima snažnu denaturaciju u RNKazu.To je trenutno najefikasniji inhibitor RNaze.

TRIzol je novi reagens za ekstrakciju ukupne RNK koji može direktno izdvojiti ukupnu RNK iz ćelija ili tkiva.Sadrži supstance kao što su fenol i gvanidin izotiocijanat, koji mogu brzo poremetiti ćelije i inhibirati nukleaze koje ćelije oslobađaju.

(Međutim, gvanidin izotiocijanat je opasan za zdravlje laboratorijskih istraživača.)

RNAsin:

Kiseli glikoprotein ekstrahovan iz jetre štakora ili ljudskog blastoderma.Rnazin je nekompetitivni inhibitor RNaze, koji se može vezati za različite RNaze kako bi ih inaktivirao.

(Više detalja: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Hvisoka temperatura:

Visoka temperatura je takođe uobičajeno sredstvo za denaturaciju proteina.

Dietilpirokarbonat (DEPC):

DEPC je jak, ali nepotpun inhibitor RNaze, koji može inhibirati aktivnost RNaze kombinovanjem sa imidazolnim prstenom aminokiseline aktivne grupe RNaze radi denaturacije proteina.

Vanadil ribonukleozid kompleks:

Kompleks formiran od jona vanadijevog oksida i nukleozida, koji se vezuje za RNKazu u obliku prelaznih supstanci, koje mogu gotovo u potpunosti inhibirati aktivnost RNKaze

ostalo:

SDS, urea, dijatomejska zemlja, itd. takođe imaju određeni inhibitorni efekat na RNazu.

Expert Reviews

Li Yujie glavni tehničar

Direktor laboratorijskog odjela, Jiaozhou bolnica, bolnica Dongfang pridružena Univerzitetu Tongji

Kako bi se spriječila biorazgradnja egzogene RNKaze, maske, rukavice i kape treba nositi i često mijenjati tokom procesa ekstrakcije RNK.Svo stakleno posuđe se mora peći u pećnici za sušenje na 200°C duže od 2 sata.Materijale koji se koriste za pečenje, kao što je plastika, potrebno je tretirati DEPC vodom, a zatim oprati destilovanom vodom.Reagensi ili uređaji koji se koriste za ekstrakciju, očuvanje i identifikaciju RNK trebaju biti posvećeni RNK, a potrebno je uspostaviti neovisno područje rada RNK.

reference:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Bakterije i virusi u nazofarinksu neposredno prije pojave akutnih infekcija donjih dišnih puteva kod autohtone australske djece[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2018, 37 (9): 1785-1794.

[2] Ogranak za kontrolu bolničkih infekcija Kineskog udruženja za preventivnu medicinu.Smjernice za sakupljanje i inspekciju kliničkih mikrobnih uzoraka [J].Kineski časopis za bolničke infekcije, 2018(20):3192-3200.

[3] “Klinički test Deset hiljada zašto test molekularne biologije”