U ranoj fazi izbijanja, zbog brzog razvoja, brza dijagnoza sumnjivih pacijenata je ključ za prevenciju COVID-19.Neki odobreni reagensi za detekciju nukleinske kiseline imaju kratko vrijeme razvoja, a postoje problemi kao što su žurna potvrda performansi, nedovoljna optimizacija reagensa i velike razlike između serija;Problemi različitih kliničkih laboratorija u različitim aspektima procesa detekcije nukleinskih kiselina također mogu utjecati na točnost rezultata detekcije nukleinskih kiselina.Ovaj članak će se fokusirati na ključne veze i točke u trenutnoj detekciji nukleinske kiseline SARS-CoV-2, te analizirati probleme lažno negativnih i pozitivnih ponovnih ispitivanja laboratorijske detekcije nukleinske kiseline i kliničke nedosljednosti.

Principi detekcije SARS-CoV-2 nukleinske kiseline

SARS-CoV-2 je RNK virus sa sekvencom genoma od oko 29 kb, sa 10 gena, koji mogu efikasno kodirati 10 proteina.Virusi se sastoje od RNK i proteina, a najudaljeniji sloj je vanjski omotač koji se sastoji od lipida i glikoproteina.Iznutra, proteinski kapsid obavija RNK u sebi, štiteći tako lako razgradljivu RNK (P1).

P1 Struktura SARS-COV-2

Virusi prodiru u ćelije kroz specifične receptore na površini ćelije da izazovu infekciju i koriste ćelije domaćina za replikaciju.

Princip otkrivanja virusne nukleinske kiseline je da se virusna RNK izloži kroz ćelijski lizat, a zatim se za detekciju koristi fluorescentna reverzna transkripcija-polimeraza lančana reakcija u realnom vremenu (RT-PCR).

Ključ principa detekcije je upotreba prajmera i sondi za postizanje "ciljanog podudaranja" sekvenci nukleinskih kiselina, odnosno pronalaženje sekvence nukleinske kiseline SARS-CoV-2 koja se razlikuje od drugih virusa u oko 30.000 baza (sličnost nukleinske kiseline sa drugim virusima) "niska" oblast), dizajn prajmera i sondi

Prajmeri i sonde su u velikoj meri usklađeni sa specifičnim regionom nukleinske kiseline SARS-CoV-2, odnosno specifičnost je veoma jaka.Jednom kada je rezultat fluorescentne RT-PCR amplifikacije u realnom vremenu za uzorak koji se testira pozitivan, to dokazuje da je SARS-CoV-2 prisutan u uzorku.Vidi P2.

P2 Koraci određivanja nukleinske kiseline SARS-CoV-2 (fluorescentna RT-PCR u realnom vremenu)

Uslovi i zahtjevi laboratorije za detekciju SARS-CoV-2 nukleinske kiseline

Laboratorije za testiranje nukleinske kiseline su najidealnije za okruženja sa negativnim pritiskom i trebale bi obratiti pažnju na praćenje pritiska, održavati protok zraka i eliminirati aerosole.Osoblje za testiranje nukleinske kiseline mora imati odgovarajuće kvalifikacije, proći odgovarajuću obuku o lančanoj reakciji polimeraze i položiti procjenu.Laboratorijom treba strogo upravljati, zonirati na mjestu, a nerelevantnom osoblju strogo je zabranjen ulazak.Čisto područje treba ventilirati i dezinficirati na mjestu.Relevantne stvari se postavljaju u zone, čiste i prljave se odvajaju, zamenjuju na vreme i dekontaminiraju na mestu.Rutinska dezinfekcija: Dezinfekciono sredstvo koje sadrži hlor je glavno rešenje za veće površine, a 75% alkohola se može koristiti za male površine.Dobar način za rješavanje aerosola je otvaranje prozora radi ventilacije, a dezinfekcija zraka se može obaviti i ultraljubičastim zrakama, filtracijom i dezinfekcijom zraka.

Ključne veze i parametri određivanja nukleinske kiseline SARS-CoV-2 (fluorescentna RT-PCR u realnom vremenu)

Iako laboratorije uglavnom posvećuju veliku pažnju „detekciji nukleinske kiseline“, zapravo, „ekstrakcija“ nukleinske kiseline je također jedan od ključnih koraka za uspješno otkrivanje, što je usko povezano sa prikupljanjem i skladištenjem uzoraka virusa.

Trenutno, najčešće korišteni respiratorni uzorci, kao što su nazofaringealni brisevi, koriste drugu metodu, a to je otopina za inaktivaciju (konzervaciju) pripremljena na bazi ekstrakcije nukleinske kiseline i otopine za lizu.S jedne strane, ovo rješenje za očuvanje virusa može denaturirati protein virusa, izgubiti njegovu aktivnost i više nije zarazno, te poboljšati sigurnost transporta i faze detekcije;s druge strane, može direktno razbiti virus kako bi oslobodio nukleinsku kiselinu, eliminirao enzim koji razgrađuje nukleinsku kiselinu i spriječio virus.RNK se razgrađuje.

Otopina za uzorkovanje virusa pripremljena na bazi otopine za lizu ekstrakcije nukleinske kiseline.Glavne komponente su izbalansirane soli, agens za keliranje etilendiamintetraoctene kiseline, so gvanidina (gvanidin izotiocijanat, gvanidin hidrohlorid, itd.), anjonski surfaktant (dodekan) natrijum sulfat), kationski surfaktant (tetradecil trimetil amonijum oksalat), i nekoliko fenol-hidro-kinolinskih proteina, difenol-hidro-kinoloksi, ili više komponenti.Trenutno postoji mnogo vrsta kompleta za ekstrakciju nukleinske kiseline, a koriste se različiti reagensi za ekstrakciju i pročišćavanje nukleinske kiseline.Čak i ako se koristi isti reagens za ekstrakciju i pročišćavanje nukleinske kiseline, postupci ekstrakcije svakog kompleta su različiti.

Trenutno, proizvodi kompleta za otkrivanje nukleinske kiseline koje je odobrila Nacionalna administracija za medicinske proizvode odabrani su na osnovu ORF1ab, E i N gena u SARS-CoV-2 genomu.Principi detekcije različitih proizvoda su u osnovi isti, ali se njihovi prajmeri i dizajn sonde razlikuju.Postoje segmenti sa jednom metom (ORF1ab), segmenti sa dvostrukom metom (ORF1ab, N ili E) i segmenti sa tri cilja (ORF1ab, N i E).Razlika između detekcije i interpretacije, ekstrakcije nukleinske kiseline i fluorescentnog RT-PCR reakcijskog sistema u realnom vremenu treba da se odnosi na relevantne upute za komplet, a preporučuje se da korisnici striktno slijede metod tumačenja koji je naveden u uputama kompleta za interpretaciju.Uobičajeni regioni, prajmeri i sekvence sonde amplificirane fluorescentnom RT-PCR u realnom vremenu prikazane su u P3.

P3 Lokacija cilja SARS-CoV-2 amplikona na genomu i sekvenca prajmera i sondi

Tumačenje rezultata određivanja nukleinske kiseline SARS-CoV-2 (Real-Time fluorescentna RT-PCR)

“Plan prevencije i kontrole upale pluća za infekciju SARS-CoV-2 (drugo izdanje)” po prvi put je razjasnio kriterije za ocjenjivanje rezultata amplifikacije jednog gena:

1. Nijedan Ct ili Ct≥40 nije negativan;

2. Ct<37 je pozitivan;

3. Ct vrijednost od 37-40 je oblast sive skale.Preporučljivo je ponoviti eksperiment.Ako rezultat ponovnog izvođenja Ct<40 i krivulja pojačanja imaju očigledne vrhove, uzorak se smatra pozitivnim, u suprotnom je negativan.”

Treće izdanje vodiča i četvrto izdanje vodiča nastavili su gore navedene kriterije.Međutim, zbog različitih meta koje se koriste u komercijalnim kompletima, gore pomenuto 3. izdanje vodiča nije dalo kriterijume za određivanje kombinacije meta, naglašavajući da će preovladavati uputstva proizvođača.Počevši od petog izdanja smjernica, razjašnjena su dva cilja, posebno kriteriji procjene za jednu metu o kojoj je teško procijeniti.Odnosno, ako laboratorij želi potvrditi da je slučaj pozitivan na otkrivanje SARS-CoV-2 nukleinske kiseline, potrebno je ispuniti sljedeće 1 od 2 uslova:

(1) Dvije mete SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) u istom uzorku su pozitivne fluorescentnom RT-PCR u realnom vremenu.Ako je jedna meta pozitivna, potrebno je ponovno uzorkovanje i ponovno testiranje.Ako su rezultati testa Ako je pojedinačna meta i dalje pozitivna, smatra se pozitivnim.

(2) Dva uzorka fluorescentnog RT-PCR-a u realnom vremenu pokazala su jednu metu pozitivnu u isto vrijeme ili dva uzorka istog tipa pokazala su jedan ciljni pozitivan rezultat testa, koji se može ocijeniti pozitivnim.Međutim, smjernice također naglašavaju da negativni rezultati testiranja na nukleinske kiseline ne mogu isključiti infekciju SARS-CoV-2.Potrebno je isključiti faktore koji mogu uzrokovati lažno negativne rezultate, uključujući lošu kvalitetu uzorka (uzorci disajnih puteva iz orofarinksa i drugih dijelova), prerano ili prekasno uzimanje uzoraka, Uzorci nisu pravilno pohranjeni, transportirani i obrađeni, a sama tehnologija je imala problema (varijacija virusa, PCR inhibicija) itd.

Uzroci lažno negativnih rezultata u otkrivanju SARS-CoV-2

Koncept “lažno negativnog” u testiranju na nukleinsku kiselinu koji je trenutno u pitanju, često se odnosi na “lažno negativne” u kojima rezultati testa nukleinske kiseline nisu u skladu s kliničkim manifestacijama, to jest, klinički simptomi i rezultati snimanja su vrlo sumnjivi na COVID-19, ali testovi nukleinske kiseline su uvijek mnogo puta “negativni”.Klinički laboratorijski centar Nacionalne zdravstvene komisije objasnio je "lažno negativan" SARS-CoV-2 test.

(1) U ćelijama zaražene osobe postoji određena količina virusa.Postojeći podaci pokazuju da nakon zaraze organizma virusom virus ulazi u grlo kroz nos i usta, zatim u dušnik i bronhije, a zatim dospijeva u alveole.Zaražena osoba će doživjeti period inkubacije, blage simptome, a zatim proces teških simptoma, te različite stadije bolesti.I količina virusa prisutna u različitim dijelovima tijela je različita.

U smislu virusnog opterećenja tipova ćelija, alveolarne epitelne ćelije (donji respiratorni trakt)> epitelne ćelije disajnih puteva (gornji respiratorni trakt)> fibroblasti, endotelne ćelije i makrofagi, itd.;iz vrste uzorka, alveolarna lavaža (najodličnija)>sputum za duboki kašalj>bris nazofarinksa>bris orofarinksa>krv.Osim toga, virus se može otkriti iu fecesu.Međutim, s obzirom na pogodnost operacije i prihvaćanje pacijenata, uobičajeno korišteni klinički redoslijed uzorka je bris orofarinksa>bris nazofarinksa>tečnost za ispiranje bronha (kompleksna operacija) i duboki sputum (obično suv kašalj, teško se može dobiti).

Stoga je količina virusa u ćelijama orofarinksa ili nazofarinksa kod nekih pacijenata mala ili izuzetno niska.Ako se za testiranje uzimaju samo uzorci orofarinksa ili nazofarinksa, virusna nukleinska kiselina neće biti otkrivena.

(2) Tokom prikupljanja uzoraka nisu sakupljene ćelije koje sadrže virus ili virusna nukleinska kiselina nije efikasno očuvana.

[① Neodgovarajuće mjesto za prikupljanje, na primjer, kada se uzimaju orofaringealni brisevi, dubina sakupljanja nije dovoljna, sakupljeni brisevi nazofarinksa se ne sakupljaju duboko u nosnoj šupljini, itd. Većina prikupljenih ćelija mogu biti ćelije bez virusa;

② Brisovi za uzorkovanje se koriste pogrešno.Na primjer, sintetička vlakna kao što su PE vlakna, poliesterska vlakna i polipropilenska vlakna preporučuju se za materijal glave štapića.Prirodna vlakna kao što su pamuk se koriste u stvarnom radu (snažna adsorpcija proteina i nije lako isprati) i najlonska vlakna (loša apsorpcija vode, što dovodi do nedovoljne zapremine uzorkovanja);

③Nepravilna upotreba epruveta za skladištenje virusa, kao što je zloupotreba polipropilenskih ili polietilenskih plastičnih epruveta za skladištenje koje lako apsorbuju nukleinske kiseline (DNK/RNA), što dovodi do smanjenja koncentracije nukleinske kiseline u rastvoru za skladištenje.U praksi se preporučuje upotreba polietilen-propilen polimer plastike i nekih posebno obrađenih polipropilenskih plastičnih kontejnera za skladištenje virusnih nukleinskih kiselina.]

[① Neodgovarajuće mjesto za prikupljanje, na primjer, kada se uzimaju orofaringealni brisevi, dubina sakupljanja nije dovoljna, sakupljeni brisevi nazofarinksa se ne sakupljaju duboko u nosnoj šupljini, itd. Većina prikupljenih ćelija mogu biti ćelije bez virusa;

② Brisovi za uzorkovanje se koriste pogrešno.Na primjer, sintetička vlakna kao što su PE vlakna, poliesterska vlakna i polipropilenska vlakna preporučuju se za materijal glave štapića.Prirodna vlakna kao što su pamuk se koriste u stvarnom radu (snažna adsorpcija proteina i nije lako isprati) i najlonska vlakna (loša apsorpcija vode, što dovodi do nedovoljne zapremine uzorkovanja);

③Nepravilna upotreba epruveta za skladištenje virusa, kao što je zloupotreba polipropilenskih ili polietilenskih plastičnih epruveta za skladištenje koje lako apsorbuju nukleinske kiseline (DNK/RNA), što dovodi do smanjenja koncentracije nukleinske kiseline u rastvoru za skladištenje.U praksi se preporučuje upotreba polietilen-propilen polimer plastike i nekih posebno obrađenih polipropilenskih plastičnih kontejnera za skladištenje virusnih nukleinskih kiselina.]

(4) Rad kliničke laboratorije nije standardiziran.Uslovi transporta i skladištenja uzoraka, standardizovan rad kliničkih laboratorija, interpretacija rezultata i kontrola kvaliteta ključni su faktori koji osiguravaju tačnost i pouzdanost rezultata ispitivanja.Prema rezultatima eksterne evaluacije kvaliteta koju je Kliničko-laboratorijski centar Nacionalne zdravstvene komisije sproveo od 16. do 24. marta 2020. godine, od 844 laboratorije koje su dobile validne rezultate, 701 (83,1%) je kvalifikovano, a 143 (16,9%) nije.Kvalifikovani, ukupni laboratorijski uslovi ispitivanja su dobri, ali različite laboratorije i dalje imaju razlike u sposobnosti osoblja, sposobnosti interpretacije pozitivnog uzorka za jednu metu i kontrole kvaliteta.

Kako smanjiti lažno negativnu detekciju SARS-CoV-2 nukleinske kiseline?

Smanjenje lažno negativnih rezultata u detekciji nukleinske kiseline trebalo bi optimizirati sa četiri aspekta stvaranja lažnih negativnih rezultata.

(1) U ćelijama zaražene osobe postoji određena količina virusa.Koncentracija virusa u različitim dijelovima tijela za koje se sumnja da su zaražene bit će različita u različito vrijeme.Ako nema ždrijela, može biti u tečnosti za ispiranje bronha ili fecesu.Ako se više vrsta uzoraka može prikupiti u isto vrijeme ili u različitim fazama progresije bolesti za testiranje, pomoći će da se izbjegnu lažno negativni rezultati.

(2) Ćelije koje sadrže virus treba da se sakupe tokom uzimanja uzoraka.Ovaj problem se u velikoj mjeri može riješiti jačanjem obuke sakupljača uzoraka.

(3) Pouzdani IVD reagensi.Provođenjem istraživanja o procjeni učinka detekcije reagensa na nacionalnom nivou i razmatranjem postojećih problema, efikasnost detekcije reagensa može se dodatno poboljšati i osjetljivost analize.

(4) Standardizovan rad kliničkih laboratorija.Jačanjem obuke laboratorijskog osoblja, kontinuiranim unapređenjem sistema upravljanja kvalitetom laboratorije, osiguravanjem razumne podjele i poboljšanjem sposobnosti osoblja za otkrivanje, moguće je smanjiti lažne negativne rezultate zbog nepravilnog rada laboratorije.

Razlozi za ponovni pozitivan test na SARS-CoV-2 nukleinsku kiselinu kod oporavljenih i otpuštenih pacijenata

„Plan dijagnoze i liječenja COVID-19 (probno sedmo izdanje)“ jasno propisuje da je jedan od kriterija za izliječenje i otpuštanje pacijenata sa COVID-19 iz bolnice da dva uzastopna uzorka respiratornog trakta imaju negativan test na nukleinsku kiselinu (razmak od najmanje 24 sata), ali je vrlo malo. Razlog je opet pozitivan na SARS-CoV-2.

(1)SARS-CoV-2 je novi virus.Potrebno je dalje razumjeti njegov patogeni mehanizam, potpunu sliku uzrokovane bolesti i karakteristike toka bolesti.Stoga je, s jedne strane, potrebno pojačati zbrinjavanje otpuštenih pacijenata i provesti 14-dnevno medicinsko posmatranje.Sprovoditi praćenje, praćenje zdravlja i zdravstveno usmjeravanje radi produbljivanja razumijevanja cjelokupnog procesa nastanka, razvoja i ishoda bolesti.

(2) Pacijent može ponovo biti zaražen virusom.Akademik Zhong Nanshan je rekao: Budući da izliječeni pacijenti imaju antitijela, SARS-CoV-2 se može eliminirati antitijelima kada ponovo napadnu.Postoji mnogo razloga koji mogu biti uzrok oporavljenog pacijenta, ili mogu biti povezani s mutacijom virusa, pa čak i uzrokom laboratorijskih pretraga.Ako se radi o samom virusu, mutacija SARS-CoV-2 može uzrokovati da antitijelo koje proizvodi oporavljeni pacijent bude neučinkovito protiv mutiranog virusa.Ako je pacijent ponovo zaražen mutiranim virusom, test nukleinske kiseline može biti ponovo pozitivan.

(3) Što se tiče laboratorijskih metoda ispitivanja, svaka metoda ispitivanja ima svoja ograničenja.Detekcija SARS-CoV-2 nukleinske kiseline je zbog izbora sekvence gena, sastava reagensa, osjetljivosti metode i drugih razloga, što dovodi do toga da postojeći setovi imaju svoje donje granice detekcije.Nakon što se pacijent liječi, virus u tijelu se smanjuje.Kada je virusno opterećenje u uzorku koji se testira ispod donje granice detekcije, pojavit će se “negativan” rezultat.Međutim, ovaj rezultat ne znači da je virus u tijelu potpuno nestao.Virus može biti nakon prekida liječenja.Resurgence”, nastavi kopirati.Stoga se preporučuje pregled jednom sedmično u roku od 2 do 4 sedmice nakon otpuštanja.

(4) Nukleinska kiselina je genetski materijal virusa.Virus se ubija nakon što je pacijent podvrgnut antivirusnoj terapiji, ali preostali fragmenti virusne RNK se i dalje zadržavaju u ljudskom tijelu i nisu u potpunosti izbačeni iz tijela.Ponekad, pod određenim okolnostima, može se više zadržati.Dugo vremena i u ovom trenutku test nukleinske kiseline će biti "prolazno" pozitivan.Sa produženjem pacijentovog vremena oporavka, nakon što se preostali RNA fragmenti u tijelu postepeno iscrpe, rezultat testa nukleinske kiseline može postati negativan.

(5) Rezultat testa nukleinske kiseline SARS-CoV-2 samo dokazuje prisustvo ili odsustvo virusne RNK, a ne može dokazati aktivnost virusa i je li virus prenosiv.Potrebno je dokazati da li će pacijent koji ponovo ima pozitivan test na nukleinsku kiselinu ponovo postati izvor infekcije.Neophodno je izvršiti kulturu virusa na kliničkim uzorcima i kultivisati “živi” virus kako bi se dokazalo da je zarazan.

Sažetak

Ukratko, testovi SARS-CoV-2 nukleinske kiseline lažno negativni, ponovni pozitivni rezultati i druga stanja koja nisu u skladu s kliničkim manifestacijama ne mogu se u potpunosti izbjeći.U stvarnom skriningu i testiranju, preporučuje se kombiniranje kliničkih simptoma, slikovnih pregleda (CT) i eksperimenata. Laboratorijski testovi (test nukleinske kiseline + test antitijela specifičnih za virus) radi sveobuhvatne dijagnoze kako bi se spriječila promašena dijagnoza i pogrešna dijagnoza.Ako se utvrdi da rezultati testa očito nisu u skladu s kliničkim manifestacijama, preporučuje se da se provede sveobuhvatna analiza cijele veze testa (veze za prikupljanje uzoraka, cirkulaciju i obradu) kako bi se isključila moguća rana infekcija virusom SARS-CoV-2, rekurentna infekcija ili kombinacija s drugim respiratornim virusnim infekcijama itd.Ako uslovi dozvoljavaju, preporučuje se prikupljanje osjetljivijih uzoraka kao što su sputum ili tekućina iz alveolarne lavaže za ponovno ispitivanje.

Srodni proizvodi:

Komplet za detekciju nukleinske kiseline SARS-CoV-2 (metoda multipleksne PCR fluorescentne sonde)