• PCR je metoda koja se koristi za amplifikaciju DNK iz male količine DNK šablona.RT-PCR koristi reverznu transkripciju za proizvodnju DNK šablona iz RNK izvora koji se zatim može pojačati.
• PCR i RT-PCR su tipično reakcije krajnje tačke, dok qPCR i RT-qPCR koriste kinetiku brzine sinteze proizvoda tokom PCR reakcije da kvantitiraju količinu prisutnog šablona.
• Novije metode, kao što je digitalni PCR, daju apsolutnu kvantifikaciju početnog DNK šablona, ​​dok metode kao što je izotermni PCR smanjuju potrebu za skupom opremom kako bi se dali pouzdani rezultati.

Lančana reakcija polimerazom (PCR) je relativno jednostavna i široko korištena tehnika molekularne biologije za amplifikaciju i detekciju DNK i RNK sekvenci.U poređenju s tradicionalnim metodama kloniranja i amplifikacije DNK, koje često mogu potrajati danima, PCR zahtijeva samo nekoliko sati.PCR je visoko osjetljiv i zahtijeva minimalan šablon za detekciju i amplifikaciju specifičnih sekvenci.Osnovne PCR metode su dalje napredovale od jednostavne detekcije DNK i RNK.U nastavku smo dali pregled različitih PCR metoda i reagensa koje nudimo u Enzo Life Sciences za vaše potrebe istraživanja.Cilj nam je pomoći naučnicima da brzo pristupe PCR reagensima za korištenje u svom sljedećem istraživačkom projektu!

PCR

Za standardni PCR, sve što vam je potrebno je DNK polimeraza, magnezijum, nukleotidi, prajmeri, DNK šablon za amplificiranje i termocikler.PCR mehanizam je jednostavan koliko i njegova svrha: 1) dvolančana DNK (dsDNA) je toplotno denaturirana, 2) prajmeri su poravnati sa pojedinačnim lancima DNK, i 3) prajmeri su produženi pomoću DNK polimeraze, što rezultira dvije kopije originalni DNK lanac.Proces denaturacije, žarenja i elongacije tokom niza temperatura i vremena poznat je kao jedan ciklus amplifikacije (slika 1).

Svaki korak ciklusa treba optimizirati za korišćeni šablon i set prajmera.Ovaj ciklus se ponavlja otprilike 20-40 puta, a amplificirani proizvod se zatim može analizirati, obično pomoću agaroznog gela (slika 2).

Kako je PCR visoko osjetljiva metoda i za pojedinačne reakcije su potrebne vrlo male količine, preporučuje se priprema glavne mješavine za nekoliko reakcija.Glavna mješavina mora biti dobro izmiješana, a zatim podijeljena po broju reakcija, osiguravajući da svaka reakcija sadrži istu količinu enzima, dNTP-a i prajmera.Mnogi dobavljači, kao što je Enzo Life Sciences, također nude PCR mješavine koje već sadrže sve osim prajmera i DNK šablona.

Regije bogate gvaninom/citozinom (bogate GC) predstavljaju izazov u standardnim PCR tehnikama.Sekvence bogate GC su stabilnije od sekvenci sa nižim sadržajem GC.Nadalje, sekvence bogate GC imaju tendenciju da formiraju sekundarne strukture, kao što su ukosnice.Kao rezultat toga, dvostruke lančiće bogate GC teško je potpuno razdvojiti tokom faze denaturacije.Posljedično, DNK polimeraza ne može sintetizirati novi lanac bez smetnji.Viša temperatura denaturacije to može poboljšati, a prilagođavanja prema višoj temperaturi žarenja i kraćem vremenu žarenja mogu spriječiti nespecifično vezivanje prajmera bogatih GC-om.Dodatni reagensi mogu poboljšati amplifikaciju sekvenci bogatih GC.DMSO, glicerol i betain pomažu da se poremete sekundarne strukture koje su uzrokovane GC interakcijama i na taj način olakšavaju razdvajanje dvostrukih lanaca.

Hot Start PCR

Nespecifična amplifikacija je problem koji se može pojaviti tokom PCR-a.Većina DNK polimeraza koje se koriste za PCR najbolje rade na temperaturama oko 68°C do 72°C.Enzim, međutim, može biti aktivan i na nižim temperaturama, ali u nižem stepenu.Na temperaturama daleko ispod temperature žarenja, prajmeri se mogu vezati nespecifično i dovesti do nespecifične amplifikacije, čak i ako je reakcija postavljena na ledu.Ovo se može spriječiti korištenjem inhibitora polimeraze koji se odvajaju od DNK polimeraze tek kada se postigne određena temperatura, otuda i naziv PCR s vrućim startom.Inhibitor može biti antitijelo koje veže polimerazu i denaturira na početnoj temperaturi denaturacije (obično 95°C).

Polimeraza visoke vjernosti

Dok se DNK polimeraze umnožavaju prilično precizno na originalnu sekvencu šablona, ​​može doći do grešaka u podudarnosti nukleotida.Nepodudarnosti u aplikacijama kao što je kloniranje mogu rezultirati skraćenim transkriptima i pogrešno prevedenim ili neaktivnim proteinima nizvodno.Kako bi se izbjegle ove neusklađenosti, identificirane su i uključene u tok rada polimeraze sa aktivnošću „lektoriranja“.Prva polimeraza za lekturu, Pfu, identifikovana je 1991. u Pyrococcus furiosus.Ovaj enzim Pfu ima aktivnost egzonukleaze od 3' do 5'.Kako se DNK umnožava, egzonukleaza uklanja neusklađene nukleotide na 3' kraju lanca.Tada se zamjenjuje ispravan nukleotid i nastavlja se sinteza DNK.Identifikacija netačnih nukleotidnih sekvenci zasniva se na afinitetu vezivanja za ispravan nukleozid trifosfat sa enzimom, pri čemu neefikasno vezivanje usporava sintezu i omogućava ispravnu zamenu.Aktivnost korekture Pfu polimeraze rezultira manjim brojem grešaka u konačnoj sekvenci u poređenju sa Taq DNK polimerazom.Poslednjih godina identifikovani su i drugi enzimi za lekturu, a napravljene su i modifikacije originalnog enzima Pfu kako bi se dalje smanjila stopa grešaka tokom DNK amplifikacije.

RT-PCR

PCR reverzne transkripcije, ili RT-PCR, omogućava korištenje RNK kao šablona.Dodatni korak omogućava detekciju i amplifikaciju RNK.RNK se reverzno transkribuje u komplementarnu DNK (cDNK), koristeći reverznu transkriptazu.Kvalitet i čistoća RNA šablona su ključni za uspjeh RT-PCR.Prvi korak RT-PCR-a je sinteza DNK/RNA hibrida.Reverzna transkriptaza također ima funkciju RNase H, koja razgrađuje RNA dio hibrida.Jednolančana DNK molekula se zatim dovršava pomoću aktivnosti DNK-ovisne DNK polimeraze reverzne transkriptaze u cDNK.Efikasnost reakcije prvog lanca može uticati na proces amplifikacije.Od sada se standardna PCR procedura koristi za amplifikaciju cDNK.Mogućnost da se RNK vrati u cDNK pomoću RT-PCR-a ima mnoge prednosti, a prvenstveno se koristi za analizu genske ekspresije.RNK je jednolančana i vrlo nestabilna, što čini izazov za rad s njom.Obično služi kao prvi korak u qPCR-u, koji kvantificira RNA transkripte u biološkom uzorku.

qPCR i RT-qPCR

Kvantitativni PCR (qPCR) se koristi za otkrivanje, karakterizaciju i kvantifikaciju nukleinskih kiselina za brojne primjene.U RT-qPCR, RNA transkripti se često kvantificiraju tako što se prvo reverzno transkribuju u cDNK, kao što je gore opisano, a zatim se zatim provodi qPCR.Kao iu standardnom PCR-u, DNK se amplificira u tri koraka koji se ponavljaju: denaturacija, žarenje i elongacija.Međutim, u qPCR-u, fluorescentno obilježavanje omogućava prikupljanje podataka kako PCR napreduje.Ova tehnika ima mnoge prednosti zbog niza dostupnih metoda i hemija.

U qPCR baziranoj na boji (obično zeleno), fluorescentno označavanje omogućava kvantifikaciju amplificiranih molekula DNK korištenjem boje za vezivanje dsDNA.Tokom svakog ciklusa, mjeri se fluorescencija.Signal fluorescencije se povećava proporcionalno količini replicirane DNK.Dakle, DNK se kvantificira u “realnom vremenu” (slika 3).Nedostaci qPCR-a na bazi boja su to što se samo jedna meta može istovremeno ispitati i što će se boja vezati za bilo koju ds-DNK prisutnu u uzorku.

U qPCR baziranoj na sondi, mnoge mete se mogu detektovati istovremeno u svakom uzorku, ali to zahtijeva optimizaciju i dizajn sonde specifične za cilj, koja se koristi kao dodatak prajmerima.Dostupno je nekoliko tipova dizajna sonde, ali najčešći tip je sonda za hidrolizu, koja uključuje fluorofor i gasitelj.Prenos energije fluorescentne rezonance (FRET) sprečava emisiju fluorofora preko gasitelja dok je sonda netaknuta.Međutim, tokom PCR reakcije, sonda je hidrolizovana tokom produžetka prajmera i amplifikacije specifične sekvence za koju je vezana.Cepanje sonde odvaja fluorofor od gasitelja i rezultira povećanjem fluorescencije zavisno od amplifikacije (slika 4).Dakle, signal fluorescencije iz qPCR reakcije zasnovane na sondi je proporcionalan količini ciljne sekvence sonde prisutne u uzorku.Budući da je qPCR baziran na sondi specifičniji od qPCR baziran na boji, to je često tehnologija koja se koristi u dijagnostičkim testovima zasnovanim na qPCR.

Izotermna amplifikacija

Gore spomenute PCR tehnike zahtijevaju skupu opremu za termocikliranje za precizno povećanje i smanjenje temperature u komori za korake denaturacije, žarenja i ekstenzije.Razvijene su brojne tehnike za koje nisu potrebni tako precizni uređaji i mogu se izvoditi u jednostavnom vodenom kupatilu ili čak unutar ćelija od interesa.Ove tehnike se zajednički nazivaju izotermno pojačanje i rade na bazi eksponencijalnog, linearnog ili kaskadnog pojačanja.

Najpoznatiji tip izotermnog pojačanja je izotermno pojačanje posredovano petljom ili LAMP.LAMP koristi eksponencijalno pojačanje na 65⁰C za amplifikaciju DNK ili RNK šablona.Prilikom izvođenja LAMP-a, četiri do šest prajmera koji su komplementarni regionima ciljne DNK se koriste sa DNK polimerazom za sintetizaciju nove DNK.Dva od ovih prajmera imaju komplementarne sekvence koje prepoznaju sekvence u drugim prajmerima i vezuju ih, omogućavajući formiranje strukture „petlje“ u novosintetizovanoj DNK koja zatim pomaže žarenje prajmera u narednim krugovima amplifikacije.LAMP se može vizualizirati višestrukim metodama, uključujući fluorescenciju, elektroforezu u agaroznom gelu ili kolorimetriju.Lakoća vizualizacije i otkrivanja prisustva ili odsustva proizvoda kolorimetrijom i nedostatak potrebne skupe opreme učinili su LAMP pogodnom opcijom za testiranje SARS-CoV-2 u područjima gdje kliničko laboratorijsko testiranje nije bilo lako dostupno, ili skladištenje i transport uzoraka. nije bilo izvodljivo, ili u laboratorijama koje ranije nisu imale opremu za PCR termocikliranje.