Početni materijal: RNK
PCR kvantitativne reverzne transkripcije (RT-qPCR) je eksperimentalna metoda koja se koristi u PCR eksperimentima koristeći RNK kao početni materijal.U ovoj metodi, ukupna RNK ili glasnička RNK (mRNA) se prvo transkribuje u komplementarnu DNK (cDNK) pomoću reverzne transkriptaze.Zatim je izvedena qPCR reakcija koristeći cDNK kao šablon.RT-qPCR se koristi u različitim aplikacijama molekularne biologije, uključujući analizu genske ekspresije, validaciju RNA interferencije, validaciju mikromreža, detekciju patogena, genetsko testiranje i istraživanje bolesti.
Metode u jednom i dva koraka za RT-qPCR
RT-qPCR se može postići metodom u jednom ili dva koraka.RT-qPCR u jednom koraku kombinuje reverznu transkripciju i PCR amplifikaciju, omogućavajući reverznoj transkriptazi i DNK polimerazi da završe reakciju u istoj epruveti pod istim uslovima pufera.RT-qPCR u jednom koraku zahtijeva samo upotrebu prajmera specifičnih za sekvencu.U RT-qPCR u dva koraka, reverzna transkripcija i PCR amplifikacija se izvode u dvije epruvete, koristeći različite optimizirane pufere, uslove reakcije i strategije dizajna prajmera.
Prednost | Nedostatak | |
Jedan korak | Ova metoda ima manje eksperimentalne greške jer se obje reakcije odvijaju u jednoj epruveti
Manje koraka pipetiranja smanjuje rizik od kontaminacije
Pogodno za amplifikaciju/skrining visokog protoka, brzo i ponovljivo | Reakcije u dva koraka ne mogu se optimizirati odvojeno
Budući da su uvjeti reakcije ugroženi kombinacijom reakcije u dva koraka, osjetljivost nije tako dobra kao kod metode u dva koraka
Broj meta otkrivenih jednim uzorkom je mali |
Dva koraka | Sposobnost stvaranja stabilnih cDNK biblioteka koje se mogu pohraniti na duži vremenski period i koristiti u više reakcija
Ciljni geni i referentni geni mogu se amplificirati iz iste biblioteke cDNK bez potrebe za više biblioteka cDNK
Reakcioni puferi i reakcioni uslovi koji omogućavaju optimizaciju pojedinačnih reakcionih ciklusa
Fleksibilan izbor uslova okidanja | Upotreba više epruveta i više koraka pipetiranja povećava rizik od kontaminacije DNK, i dugotrajan.
Zahtijeva više optimizacije od metode u jednom koraku |
Srodni proizvodi:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Jedan korak)-SYBR Zeleni I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Jedan korak)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master premiks za prvu lančanu CDNA sintezu
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
PCR u realnom vremenu Easyᵀᴹ-Taqman
Selekcija ukupne RNK i mRNA
Prilikom dizajniranja RT-qPCR eksperimenta, važno je odlučiti hoćete li koristiti ukupnu RNK ili pročišćenu mRNA kao šablonu za reverznu transkripciju.Iako mRNA može pružiti nešto veću osjetljivost, ukupna RNK se još uvijek često koristi.Razlog za to je što ukupna RNK ima važniju prednost kao polazni materijal od mRNA.Prvo, proces zahtijeva manje koraka prečišćavanja, što osigurava bolji kvantitativni oporavak šablona i bolju normalizaciju rezultata na početni broj ćelija.Drugo, izbjegava se korak obogaćivanja mRNA, što može izbjeći mogućnost iskrivljenih rezultata zbog različitih oporavka različitih mRNA.Sve u svemu, budući da je u većini aplikacija relativna kvantifikacija ciljnog gena važnija od apsolutne osjetljivosti detekcije, ukupna RNK je prikladnija u većini slučajeva.
Prajmer za reverznu transkripciju
U metodi u dva koraka, tri različite metode se mogu koristiti za prajmer cDNK reakcije: oligo(dT) prajmeri, nasumični prajmeri ili prajmeri specifični za sekvencu.Tipično, oligo(dT) prajmeri i nasumični prajmeri se koriste u kombinaciji.Ovi prajmeri se spajaju sa šablonom mRNA lanca i daju reverznu transkriptazu sa početnom tačkom za sintezu.
Izbor prajmera | Struktura i funkcija | Prednost | Nedostatak |
Oligo(dT) prajmer (ili usidreni oligo(dT) prajmer) | Prošireno žarenje na ostatke timina na poli(A) repu mRNA;sidreni oligo(dT) prajmer sadrži G, C ili A na 3′ kraju (mjesto sidrenja) | Sinteza cDNK pune dužine iz mRNA sa poli(A) repom
Primjenjivo kada je dostupno manje polaznog materijala
Mjesto sidrenja osigurava da se oligo(dT) prajmer veže za 5′ poli(A) rep mRNA | Pogodno samo za amplifikaciju gena sa poli(A) repovima
Nabavite cDNK skraćenu sa mjesta prajminga*2 u poli(A)
Pristrasno vezati se za kraj 3′*
*Ova mogućnost je minimizirana ako se koriste usidreni oligo(dT) prajmeri |
random primer
| 6 do 9 baza u dužinu, koje se mogu pričvrstiti na više mjesta tokom transkripcije RNK | Spajanje na sve RNA (tRNA, rRNA i mRNA)
Pogodno za transkripte sa značajnom sekundarnom strukturom ili kada je dostupno manje početnog materijala
Visok prinos cDNK | cDNK se reverzno transkribuje sa svih RNK, što obično nije poželjno i može razrijediti signal ciljne mRNA
dobiti skraćenu cDNK |
prajmeri specifični za sekvencu | Prilagođeni prajmeri koji ciljaju specifične sekvence mRNA | specifična biblioteka cDNK
Poboljšajte osjetljivost
Korištenje reverznih qPCR prajmera | Ograničeno samo na sintezu jednog ciljnog gena |
Reverzna transkriptaza
Reverzna transkriptaza je enzim koji koristi RNK za sintezu DNK.Neke reverzne transkriptaze imaju aktivnost RNKaze i mogu razgraditi RNK lance u RNA-DNK hibridnim lancima nakon transkripcije.Ako nema enzimsku aktivnost RNase, može se dodati RNaseH za veću efikasnost qPCR.Često korišteni enzimi uključuju Moloney reverznu transkriptazu virusa mišje leukemije i reverznu transkriptazu virusa mijeloblastoma ptica.Za RT-qPCR idealno je odabrati reverznu transkriptazu sa većom termostabilnošću, tako da se sinteza cDNA može izvoditi na višim temperaturama, osiguravajući uspješnu transkripciju RNK sa višom sekundarnom strukturom, uz održavanje njihove pune aktivnosti tokom cijele reakcije, što rezultira većim prinosima cDNK.
Srodni proizvodi:
Foreasy M-MLV reverzna transkriptaza
RNase H aktivnost reverzne transkriptaze
RNaseH je u stanju da razgradi RNA lance iz RNA-DNK dupleksa, omogućavajući efikasnu sintezu dvolančane DNK.Međutim, kada se koristi duga mRNA kao šablon, RNK se može prerano razgraditi, što rezultira skraćenom cDNK.Stoga je često korisno minimizirati aktivnost RNaseH tokom kloniranja cDNK ako se želi sinteza dugih transkripata.Nasuprot tome, reverzne transkriptaze sa aktivnošću RNaze H često su korisne za qPCR aplikacije jer pospješuju otapanje RNA-DNK dupleksa tokom prvog ciklusa PCR-a.
Dizajn prajmera
PCR prajmeri koji se koriste za qPCR korak u RT-qPCR idealno bi trebali biti dizajnirani tako da pokrivaju spoj ekson-egzon, gdje bi amplifikacija prajmera mogla potencijalno proteći stvarnu granicu ekson-intron.Budući da sekvence genomske DNK koje sadrže intron nisu amplificirane, ovaj dizajn smanjuje rizik od pomnožavanja lažnih pozitivnih rezultata zbog kontaminacije genomske DNK.
Ako se prajmeri ne mogu dizajnirati da odvajaju egzone ili granice ekson-eksona, možda će biti potrebno tretirati uzorke RNK sa DNazom I ili dsDNazom bez RNaze kako bi se uklonila kontaminacija genomske DNK.
RT-qPCR kontrola
Negativna kontrola reverzne transkripcije (-RT kontrola) treba biti uključena u sve RT-qPCR eksperimente kako bi se otkrila kontaminacija DNK (kao što je genomska DNK ili PCR proizvodi iz prethodnih reakcija).Ova kontrola sadrži sve komponente reakcije osim reverzne transkriptaze.Pošto se reverzna transkripcija ne dešava sa ovom kontrolom, ako se uoči PCR amplifikacija, kontaminacija iz DNK je najverovatnije.
Vrijeme objave: 02.08.2022