• facebook
  • linkedin
  • youtube

Početni materijal: RNK

PCR kvantitativne reverzne transkripcije (RT-qPCR) je eksperimentalna metoda koja se koristi u PCR eksperimentima koristeći RNK kao početni materijal.U ovoj metodi, ukupna RNK ili glasnička RNK (mRNA) se prvo transkribuje u komplementarnu DNK (cDNK) pomoću reverzne transkriptaze.Zatim je izvedena qPCR reakcija koristeći cDNK kao šablon.RT-qPCR se koristi u različitim aplikacijama molekularne biologije, uključujući analizu genske ekspresije, validaciju RNA interferencije, validaciju mikromreža, detekciju patogena, genetsko testiranje i istraživanje bolesti.

Metode u jednom i dva koraka za RT-qPCR

RT-qPCR se može postići metodom u jednom ili dva koraka.RT-qPCR u jednom koraku kombinuje reverznu transkripciju i PCR amplifikaciju, omogućavajući reverznoj transkriptazi i DNK polimerazi da završe reakciju u istoj epruveti pod istim uslovima pufera.RT-qPCR u jednom koraku zahtijeva samo upotrebu prajmera specifičnih za sekvencu.U RT-qPCR u dva koraka, reverzna transkripcija i PCR amplifikacija se izvode u dvije epruvete, koristeći različite optimizirane pufere, uslove reakcije i strategije dizajna prajmera.

članak 1

 

Prednost

Nedostatak

Jedan korak Ova metoda ima manje eksperimentalne greške jer se obje reakcije odvijaju u jednoj epruveti

 

Manje koraka pipetiranja smanjuje rizik od kontaminacije

 

Pogodno za amplifikaciju/skrining visokog protoka, brzo i ponovljivo

Reakcije u dva koraka ne mogu se optimizirati odvojeno

 

Budući da su uvjeti reakcije ugroženi kombinacijom reakcije u dva koraka, osjetljivost nije tako dobra kao kod metode u dva koraka

 

Broj meta otkrivenih jednim uzorkom je mali

Dva koraka Sposobnost stvaranja stabilnih cDNK biblioteka koje se mogu pohraniti na duži vremenski period i koristiti u više reakcija

 

Ciljni geni i referentni geni mogu se amplificirati iz iste biblioteke cDNK bez potrebe za više biblioteka cDNK

 

Reakcioni puferi i reakcioni uslovi koji omogućavaju optimizaciju pojedinačnih reakcionih ciklusa

 

Fleksibilan izbor uslova okidanja

Upotreba više epruveta i više koraka pipetiranja povećava rizik od kontaminacije DNK,

i dugotrajan.

 

Zahtijeva više optimizacije od metode u jednom koraku

Srodni proizvodi:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Jedan korak)-SYBR Zeleni I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Jedan korak)-Taqman

RT Easyᵀᴹ I Master premiks za prvu lančanu CDNA sintezu

Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

PCR u realnom vremenu Easyᵀᴹ-Taqman

Selekcija ukupne RNK i mRNA

Prilikom dizajniranja RT-qPCR eksperimenta, važno je odlučiti hoćete li koristiti ukupnu RNK ili pročišćenu mRNA kao šablonu za reverznu transkripciju.Iako mRNA može pružiti nešto veću osjetljivost, ukupna RNK se još uvijek često koristi.Razlog za to je što ukupna RNK ima važniju prednost kao polazni materijal od mRNA.Prvo, proces zahtijeva manje koraka prečišćavanja, što osigurava bolji kvantitativni oporavak šablona i bolju normalizaciju rezultata na početni broj ćelija.Drugo, izbjegava se korak obogaćivanja mRNA, što može izbjeći mogućnost iskrivljenih rezultata zbog različitih oporavka različitih mRNA.Sve u svemu, budući da je u većini aplikacija relativna kvantifikacija ciljnog gena važnija od apsolutne osjetljivosti detekcije, ukupna RNK je prikladnija u većini slučajeva.

Prajmer za reverznu transkripciju

U metodi u dva koraka, tri različite metode se mogu koristiti za prajmer cDNK reakcije: oligo(dT) prajmeri, nasumični prajmeri ili prajmeri specifični za sekvencu.Tipično, oligo(dT) prajmeri i nasumični prajmeri se koriste u kombinaciji.Ovi prajmeri se spajaju sa šablonom mRNA lanca i daju reverznu transkriptazu sa početnom tačkom za sintezu.

članak 2

Izbor prajmera Struktura i funkcija Prednost Nedostatak
Oligo(dT) prajmer (ili usidreni oligo(dT) prajmer) Prošireno žarenje na ostatke timina na poli(A) repu mRNA;sidreni oligo(dT) prajmer sadrži G, C ili A na 3′ kraju (mjesto sidrenja) Sinteza cDNK pune dužine iz mRNA sa poli(A) repom

 

Primjenjivo kada je dostupno manje polaznog materijala

 

Mjesto sidrenja osigurava da se oligo(dT) prajmer veže za 5′ poli(A) rep mRNA

Pogodno samo za amplifikaciju gena sa poli(A) repovima

 

Nabavite cDNK skraćenu sa mjesta prajminga*2 u poli(A)

 

Pristrasno vezati se za kraj 3′*

 

*Ova mogućnost je minimizirana ako se koriste usidreni oligo(dT) prajmeri

random primer

 

6 do 9 baza u dužinu, koje se mogu pričvrstiti na više mjesta tokom transkripcije RNK Spajanje na sve RNA (tRNA, rRNA i mRNA)

 

Pogodno za transkripte sa značajnom sekundarnom strukturom ili kada je dostupno manje početnog materijala

 

Visok prinos cDNK

cDNK se reverzno transkribuje sa svih RNK, što obično nije poželjno i može razrijediti signal ciljne mRNA

 

dobiti skraćenu cDNK

prajmeri specifični za sekvencu Prilagođeni prajmeri koji ciljaju specifične sekvence mRNA specifična biblioteka cDNK

 

Poboljšajte osjetljivost

 

Korištenje reverznih qPCR prajmera

Ograničeno samo na sintezu jednog ciljnog gena

Reverzna transkriptaza

Reverzna transkriptaza je enzim koji koristi RNK za sintezu DNK.Neke reverzne transkriptaze imaju aktivnost RNKaze i mogu razgraditi RNK lance u RNA-DNK hibridnim lancima nakon transkripcije.Ako nema enzimsku aktivnost RNase, može se dodati RNaseH za veću efikasnost qPCR.Često korišteni enzimi uključuju Moloney reverznu transkriptazu virusa mišje leukemije i reverznu transkriptazu virusa mijeloblastoma ptica.Za RT-qPCR idealno je odabrati reverznu transkriptazu sa većom termostabilnošću, tako da se sinteza cDNA može izvoditi na višim temperaturama, osiguravajući uspješnu transkripciju RNK sa višom sekundarnom strukturom, uz održavanje njihove pune aktivnosti tokom cijele reakcije, što rezultira većim prinosima cDNK.

Srodni proizvodi:

Foreasy M-MLV reverzna transkriptaza

RNase H aktivnost reverzne transkriptaze

RNaseH je u stanju da razgradi RNA lance iz RNA-DNK dupleksa, omogućavajući efikasnu sintezu dvolančane DNK.Međutim, kada se koristi duga mRNA kao šablon, RNK se može prerano razgraditi, što rezultira skraćenom cDNK.Stoga je često korisno minimizirati aktivnost RNaseH tokom kloniranja cDNK ako se želi sinteza dugih transkripata.Nasuprot tome, reverzne transkriptaze sa aktivnošću RNaze H često su korisne za qPCR aplikacije jer pospješuju otapanje RNA-DNK dupleksa tokom prvog ciklusa PCR-a.

Dizajn prajmera

PCR prajmeri koji se koriste za qPCR korak u RT-qPCR idealno bi trebali biti dizajnirani tako da pokrivaju spoj ekson-egzon, gdje bi amplifikacija prajmera mogla potencijalno proteći stvarnu granicu ekson-intron.Budući da sekvence genomske DNK koje sadrže intron nisu amplificirane, ovaj dizajn smanjuje rizik od pomnožavanja lažnih pozitivnih rezultata zbog kontaminacije genomske DNK.

Ako se prajmeri ne mogu dizajnirati da odvajaju egzone ili granice ekson-eksona, možda će biti potrebno tretirati uzorke RNK sa DNazom I ili dsDNazom bez RNaze kako bi se uklonila kontaminacija genomske DNK.

RT-qPCR kontrola

Negativna kontrola reverzne transkripcije (-RT kontrola) treba biti uključena u sve RT-qPCR eksperimente kako bi se otkrila kontaminacija DNK (kao što je genomska DNK ili PCR proizvodi iz prethodnih reakcija).Ova kontrola sadrži sve komponente reakcije osim reverzne transkriptaze.Pošto se reverzna transkripcija ne dešava sa ovom kontrolom, ako se uoči PCR amplifikacija, kontaminacija iz DNK je najverovatnije.


Vrijeme objave: 02.08.2022