COVID-19 je zarazna bolest uzrokovana teškim akutnim respiratornim sindromom koronavirusom tipa 2. Kada je osoba zaražena, najčešći simptomi uključuju groznicu, kašalj i kratak dah.

Uzorci koji se koriste za testiranje mogu se uzeti brisevima nazofarinksa ili orofaringealnih briseva.

Šta je PCR?

Standardna metoda otkrivanja koronavirusa je polimerazna lančana reakcija, PCR.Ovo je metoda koja se široko koristi u molekularnoj biologiji.Može brzo kopirati milione do milijarde specifičnih fragmenata DNK.

Novi koronavirus sadrži veoma dug jednolančani RNA genom.Da bi se ovi virusi otkrili PCR-om, RNK molekuli moraju biti pretvoreni u njihove komplementarne DNK sekvence pomoću reverzne transkriptaze, a zatim se novosintetizirana DNK može amplificirati standardnim PCR procedurama, što je uobičajeno poznato kao RT-PCR.

RT-PCR proces

Ekstrakcija RNK

Da bi se izvršila ova metoda, virusna RNK u osnovi treba biti ekstrahirana.Različiti kompleti za prečišćavanje RNK mogu se koristiti za praktično, brzo i efikasno odvajanje.

Za ekstrakciju virusne RNK pomoću komercijalnog kompleta, prvo dodajte uzorak u epruvetu za mikrocentrifugu, a zatim ga pomiješajte s puferom za lizu.Ovaj pufer je visoko denaturiran i obično se sastoji od fenola i gvanidin izotiocijanata.Osim toga, inhibitori RNaze su obično prisutni u puferu za lizu kako bi se osigurala izolacija intaktne virusne RNK.

Nakon dodavanja pufera za lizu, vorteksirajte epruvetu za miješanje pulsom i inkubirajte na sobnoj temperaturi.Virus se zatim lizira u uslovima visoke denaturacije koje obezbeđuje pufer za lizu.

Nakon što se uzorak lizira, za postupak prečišćavanja koristi se epruveta za centrifugiranje.Uzorak se stavlja u epruvetu za centrifugiranje i zatim centrifugira.

Ovaj postupak je metoda ekstrakcije čvrste faze u kojoj se stacionarna faza sastoji od matrice silika gela.

Pod optimalnim uslovima soli i pH, molekuli RNK se vezuju za membranu silicijum dioksida.

Istovremeno se uklanjaju proteini i drugi zagađivači.

Nakon centrifugiranja, stavite centrifugalnu epruvetu u čistu epruvetu za sakupljanje, bacite filtrat, a zatim dodajte pufer za pranje.

Ponovo stavite epruvetu u centrifugu kako bi pufer za pranje progurao kroz membranu.Ovo će ukloniti sve preostale nečistoće iz membrane, ostavljajući samo RNK vezanu za silika gel.

Nakon što je uzorak ispran, stavite epruvetu u čistu epruvetu za mikrocentrifugu i dodajte pufer za eluiranje.

Zatim se centrifugira kako bi se pufer za eluiranje progurao kroz membranu.Pufer za eluiranje uklanja virusnu RNK iz spin kolone i dobija prečišćenu RNK bez proteina, inhibitora i drugih kontaminanata.

KORAK 2

Miješani koncentrat

Nakon ekstrakcije virusne RNK, sljedeći korak je priprema reakcione smjese za PCR amplifikaciju.U ovom koraku se koristi koncentrat.Ova koncentrovana otopina je prethodno izmiješana koncentrirana otopina koja se sastoji od premiksa, reverzne transkriptaze, nukleotida, naprijed prajmera, reverznog prajmera, TaqMan sonde i DNK polimeraze.

Konačno, da bi se završila ova reakcijska smjesa, dodaje se RNA šablon.Epruvete se miješaju pulsnim vorteksiranjem, a zatim se reakciona smjesa stavlja u PCR ploču.PCR ploča obično sadrži 96 jažica i može analizirati više uzoraka u isto vrijeme.

KORAK 3

PCR amplifikacija

Zatim stavite ploču u PCR mašinu, koja je u suštini termalni ciklus.

RT-PCR u realnom vremenu koristi se za otkrivanje novog koronavirusa iz 2019. amplifikacijom ciljne sekvence u genu RdrRP, genu E i N genu.Izbor ciljnog gena zavisi od prajmera i sekvence sonde.

Prvi korak RT-PCR-a je reverzna transkripcija.Sintetiše se prvi lanac komplementarne DNK, koji je iniciran PCR reverznim prajmerom, koji se vezuje za komplementarni dio genoma virusne RNK.Zatim reverzna transkriptaza dodaje nukleotide DNK na 3′kraj prajmera kako bi se sintetizirala DNK komplementarna virusnoj RNK.Temperatura i trajanje ovog koraka zavise od korištenih prajmera, ciljne RNK i reverzne transkriptaze.

Zatim se primjenjuje početni korak denaturacije, koji rezultira denaturacijom RNA-DNK hibrida.Ovaj korak je neophodan za aktiviranje DNK polimeraze.U isto vrijeme, reverzna transkriptaza je inaktivirana.

PCR se sastoji od niza termičkih ciklusa.Svaki ciklus se sastoji od koraka denaturacije, žarenja i ekstenzije.

Korak denaturacije uključuje zagrijavanje reakcione komore na 95 stepeni Celzijusa i korištenje iste za denaturaciju dvolančane DNK šablone.

U sljedećem koraku, reakciona temperatura se smanjuje na 58 stepeni Celzijusa, omogućavajući prednjem prajmeru da se žari na komplementarnom dijelu svoje jednolančane DNK šablone.Temperatura žarenja direktno zavisi od dužine i sastava prajmera.

U koraku ekstenzije, DNK polimeraza sintetizira novi lanac DNK koji je komplementaran lancu DNK šablona.Dodavanjem slobodnih jezgara komplementarnih šablonu u smjeru 5′ do 3′ iz reakcione smjese.Temperatura ovog koraka ovisi o korištenoj DNK polimerazi.

Nakon prvog ciklusa dobija se dvolančana DNK meta.

Zatim uđite u drugi ciklus.Dvolančana DNK se denaturira kako bi se dobila dva jednolančana DNK molekula.

U sljedećem koraku, temperatura reakcije se snižava, prajmeri se žare na svaki jednolančani DNK šablon, a Taq-man sonda se žari na komplementarni dio ciljne DNK.

TaqMan sonda se sastoji od fluorofora kovalentno vezanog za 5′kraj oligonukleotidne sonde.Kada je pobuđen izvorom svjetlosti ciklera, fluorofor emituje fluorescenciju.Osim toga, sonda je sastavljena od prigušivača na 3′kraju.Blizina reporterskog gena gasitelju sprečava detekciju fluorescencije.

U koraku ekstenzije, DNK polimeraza sintetizira novi lanac.Kada polimeraza dođe do TaqMan sonde, njena endogena aktivnost 5'nukleaze cijepa sondu, odvajajući boju od sredstva za gašenje.

Sa svakim ciklusom PCR-a oslobađa se više molekula boje, što rezultira povećanjem intenziteta fluorescencije proporcionalno broju sintetiziranih amplikona.

Ova metoda omogućava procjenu broja date sekvence prisutne u uzorku.Broj fragmenata dvolančanih DNK se udvostručuje u svakom ciklusu.Stoga se PCR može koristiti za analizu vrlo malih uzoraka.

Za mjerenje fluorescentnog signala, volframove halogene sijalice, ekscitacionog filtera, reflektora, sočiva, emisionog filtera i uređaja sa spojenim punjenjem koristite CCD kameru.

KORAK 4 Otkrivanje

Za mjerenje fluorescentnog signala, volframove halogene sijalice, ekscitacionog filtera, reflektora, sočiva, emisionog filtera i uređaja sa spojenim punjenjem koristite CCD kameru.

Filtrirano svjetlo iz lampe reflektira se od reflektora, prolazi kroz kondenzatorsko sočivo i fokusira se na centar svake rupe.Tada se fluorescencija koja se emituje iz rupe reflektuje od ogledala, prolazi kroz emisioni filter i detektuje je CCD kamerom.U svakom PCR ciklusu, samopobuđenu fluorofornu svjetlost može detektirati CCD.

Uhvaćeno svjetlo pretvara u digitalne podatke.Ova metoda se naziva PCR u realnom vremenu i omogućava praćenje toka PCR reakcije u realnom vremenu.