1. Otkrijte apsorpciju otopine RNK
Apsorpcija na 280, 320, 230 i 260 nm predstavlja vrijednosti nukleinske kiseline, pozadine (zamućenost rastvora), koncentracije soli i organske materije kao što je protein, respektivno.Općenito gledajte samo OD260/OD280 (omjer, R).Kada je 1,8~2,0, mislimo da se kontaminacija proteina ili druge organske tvari u RNK može tolerirati, ali treba napomenuti da kada se Tris koristi kao pufer za detekciju apsorbancije, R vrijednost može biti veća od 2 (općenito bi trebala biti <2,2).Kada je R<1,8, zagađenje proteina ili druge organske materije u rastvoru je očiglednije, a sudbina RNK se može odrediti prema potrebama.Kada je R>2,2, to znači da je RNK hidrolizovana u jednu nukleinsku kiselinu.
2.Elektroforetski uzorak RNK
Generalno, denaturirajući gel se koristi za elektroforezu RNK, ali ako je samo za detekciju kvaliteta RNK, denaturirajući gel nije neophodan, već se može koristiti i obični gel agaroze.Svrha elektroforeze je da se otkrije integritet 28S i 18S traka i njihov odnos, odnosno integritet razmaza mRNA.Generalno, ako su trake 28S i 18S svijetle, jasne i oštre (što se odnosi na ivice traka su jasne), a svjetlina 28S je više nego dvostruko veća od 18S trake, smatramo da je kvalitet RNK dobar.
Gore navedene su dvije metode koje obično koristimo, ali nijedna od ove dvije metode nam ne može jasno reći da li postoji rezidualna RNKaza u RNK otopini.Ako je u otopini vrlo mala količina RNaze, teško nam je to otkriti gornjom metodom, ali većina naknadnih enzimskih reakcija se odvija na temperaturi iznad 37 stepeni i dugo vremena.Na ovaj način, ako postoji vrlo mala količina RNKaze u RNK otopini, tada će postojati vrlo pogodno okruženje i vrijeme da odigraju svoju ulogu u narednim eksperimentima, a naravno eksperiment će u ovom trenutku biti hladan.U nastavku predstavljamo metodu koja može potvrditi da li postoji rezidualna RNKaza u RNK otopini.
3. Test očuvanja topline
U skladu sa koncentracijom uzorka, izvucite dvije RNK od 1000 ng iz otopine RNA i dodajte ih u epruvetu za centrifugiranje od 0,5 ml i dopunite je Tris puferom pH 7,0 do ukupne zapremine od 10 ul, a zatim zatvorite poklopac epruvete.Stavite jednu od njih u vodeno kupatilo konstantne temperature na 70°C i ostavite na toplom 1 h.Drugi dio je čuvan u frižideru na -20°C 1 h.Kada vrijeme istekne, uklonite dva uzorka za elektroforezu.Nakon što je elektroforeza završena, uporedite elektroforetske trake ova dva.Ako su ove dvije trake konzistentne ili nemaju značajnu razliku (naravno, njihove trake također ispunjavaju uvjete iz metode 2), to znači da u otopini RNK nema preostale kontaminacije RNK, a kvalitet RNK je vrlo dobar.Naprotiv, ako uzorak inkubiran na 70°C pokazuje očiglednu degradaciju, to ukazuje da postoji kontaminacija RNK u otopini RNK.
2 Eksperimentalne metode i tehnike za ekstrakciju RNK
Problemi sa kojima se često susrećemo prilikom ekstrakcije RNK su: (1) prinos RNK je nizak;(2) RNK ima ozbiljno zagađenje soli;(3) RNK ima ozbiljno zagađenje organskim rastvaračima;(4) degradacija uzorka i drugi problemi
1. Često korišteni reagensi za ekstrakciju ukupne RNK
Metoda gvanidin izotiocijanata i Trizol metoda su najčešće korištene metode za ekstrakciju ukupne RNK iz životinjskih tkiva i životinjskih stanica.Posebno je pogodan za male uzorke i tkiva koja se posebno teško izdvajaju, kao što je ekstrakcija ukupne RNK iz kože kunića i životinjskog vezivnog tkiva;osim toga, Trizol, kao reagens za lizu opšte namjene, može se koristiti i za ekstrakciju biljnih tkiva, bakterija, gljivica i drugih tkiva.Za biljna tkiva koja sadrže polisaharide i polifenole, kao što su kamelija oleifera, listovi čaja, sjemenke uljane repice, itd., CTAB metoda se također može koristiti za ekstrakciju ukupne RNK.
Kao konvencionalna metoda, metoda sa dvostrukom kolonom je također vrlo popularna zbog normalnog rada na temperaturi, nema potrebe za dodavanjem RNaze i sigurnosti – nema kloroforma, fenola i drugih organskih reagenasa za ekstrakciju.(preporučene proizvode )
2. Ekstrakcija ukupne RNK iz životinjskih tkiva
(1) Pokušajte odabrati svježu maramicu, ako nije svježa (po mogućnosti u roku od tri mjeseca - u frižideru na 80 ℃ ili zamrznuta u tečnom azotu. Kada sečete tkivo, nemojte rezati direktno na sobnoj temperaturi, obavezno ga stavite na kutiju za led, pokušajte izbjeći ponovno zamrzavanje i odmrzavanje.
(2) Koristite čiste makaze i pincetu da isečete mali komad tkiva, pokušajte da isečete centralni deo tkiva prilikom rezanja uzorka ili prvo odsecite veliki komad tkiva od sredine, a zatim isecite uzorak na mestu svežeg reza.Uklonjeno tkivo treba potpuno usitniti, usitnjeno tkivo staviti u EP epruvetu bez RNase, dodati lizat, usitnjeno tkivo treba u potpunosti izložiti lizatu i pripremiti za homogenizaciju.
(3) Za normalna tkiva odaberite tkiva veličine zrna munga (30-60 mg) za homogenizaciju.Ako tkiva sadrže veliku količinu proteina, masti ili gustog vlaknastog tkiva kao što je jetra, na odgovarajući način povećajte ili smanjite količinu isječenog tkiva (opciono) Odaberite 10~20 mg).
(4) Ako se ekstrahuju mišići ribe, meso škampa, meduze i druga tkiva sa visokim sadržajem vode, zapreminu uzorka treba na odgovarajući način povećati (preporučeno 100-200 mg).
(5) Ako uslovi dozvoljavaju, životinjsko tkivo se može direktno ekstrahovati nakon homogenizacije visokoprolaznim homogenizatorom tkiva, ako ne postoji takva oprema.
(6) RNK dobijena nakon završne ekstrakcije mora se odmah staviti na ledenu kutiju kako bi se smanjila degradacija RNK.
3. Ekstrakcija RNK iz životinjskih ćelija
(1) Ćelije za suspenziju: centrifugirajte direktno i bacite medijum, isperite sterilnim PBS-om 1-2 puta, zatim suspendujte sa odgovarajućom količinom PBS-a, a zatim dodajte lizat za lizu.Nemojte dodavati lizat direktno u precipitirane ćelije nakon što potpuno odbacite tečnost.Ovo će uzrokovati da se paket histona koji se oslobađa nakon liziranih ćelija na vanjskom sloju prianja na vanjsku stranu precipitiranih ćelija, čime se ograničava kontakt ćelija unutar peleta sa lizatom., što dovodi do nepotpune ćelijske lize i smanjenog prinosa RNK.
(2) Ćelije koje su polu-adherentne ili nisu čvrsto prianjale: Nakon odbacivanja medijuma, isperite sa PBS-om 1-2 puta, zatim direktno apsorbujte odgovarajuću količinu PBS-a i duvajte posudu za kulturu pipetom ili pištoljem kako biste otpuhali ćelije i prebacite ih u ćelije bez RNA.Dodajte lizat u EP epruvetu enzima za ekstrakciju.
(3) Adherentne ćelije: prvo ih treba probaviti tripsinom, zatim sakupiti u EP epruvete bez RNaze, centrifugirati da bi se uklonio supernatant, isprati 1-2 puta sa PBS-om da bi se uklonio višak tripsina i resuspendirati sa odgovarajućom količinom PBS-a. Zatim nastavite na korak ekstrakcije.
4. Ekstrakcija RNK biljaka
Biljna tkiva su bogata fenolnim jedinjenjima, ili su bogata polisaharidima, ili sadrže neke neidentifikovane sekundarne metabolite, ili imaju visoku aktivnost RNaze.Ove supstance se čvrsto spajaju sa RNK nakon stanične lize da bi formirale netopive komplekse ili koloidne taloge, koje je teško ukloniti.Stoga, kada vadimo biljno tkivo, moramo odabrati set za biljke.Lizat u kompletu može efikasno da reši probleme lake oksidacije polifenola i odvajanja polisaharidnih jedinjenja i nukleinskih kiselina.
(Za ekstrakciju RNA iz biljaka polisaharida polifenola, preporučeni proizvodi:
(1) Koru, pulpu, sjemenke, listove itd. biljke treba u potpunosti samljeti u malteru.Tokom procesa mlevenja, tečni azot treba dopuniti na vreme kako bi se izbeglo topljenje uzorka.Mleveni uzorak treba brzo dodati u lizat i protresti kako bi se izbjegla degradacija RNK.
(2) Za uzorke bogate vlaknima kao što su listovi pirinča i pšenice, količinu ekstrakcije treba na odgovarajući način smanjiti, inače mljevenje tkiva i liza neće biti potpuni, što rezultira niskim prinosom ekstrahirane RNK.
(3) Za biljna tkiva sa visokim sadržajem vode, kao što su plodovi nara, plodovi lubenice, plodovi breskve, itd., veličinu uzorka treba povećati na odgovarajući način (100-200 mg je opciono).
(4) Općenito se preporučuje biljnim tkivima, kao što su listovi biljaka, rizomi, tvrdi plodovi i drugi materijali, da koriste tekući dušik za temeljno malterisanje sastojaka u malteru, a zatim preći na korak ekstrakcije.Konvencionalni homogenizatori tkiva možda neće biti efikasni u homogenizaciji biljnih tkiva i generalno se ne preporučuju.
5. Mjere opreza za ekstrakciju RNK
(1) Uzorci tkiva trebaju biti što je moguće svježiji kako bi se izbjeglo ponovno smrzavanje i odmrzavanje.
(2) Pri ekstrakciji tkivo treba potpuno samljeti, a količina tkiva ne smije biti premala, a kamoli prevelika.
(3) Potrebno je dati dovoljno vremena inkubacije nakon dodavanja lizata da se uzorak potpuno lizira.
(4) Kada se koristi Trizol metoda za ekstrakciju, princip apsorpcije supernatanta nakon stratifikacije je „radije udisati manje nego udisati više“, i ne smije se ekstrahirati do srednjeg sloja, inače će uzrokovati ozbiljnu kontaminaciju genomske DNK.
(5) Prilikom pranja, tekućina za pranje treba u potpunosti infiltrirati oko stijenke cijevi kako bi se osiguralo temeljno pranje.
(6) Za metodu ekstrakcije kolone, pored odvajanja kolone nakon pranja, adsorpcionu kolonu također treba staviti u ultra čistu klupu i puhati 5-10 minuta kako bi se organski rastvarač potpuno ispario do suha.
(7) Prilikom posljednjeg eluiranja kolonske metode, nakon dodavanja DEPC vode, treba je inkubirati 3-5 minuta, ili DEPC vodu treba unaprijed zagrijati na 60°C kako bi se povećao prinos eluiranja.U tradicionalnoj metodi cijepanja Trizola i precipitacije izopropanolom, konačna RNK se rastvara u DEPC vodi, tako da treba dati odgovarajuće vrijeme za otapanje, a dno epruvete za centrifugiranje treba kontinuirano duvati vrhom pipete.
3 Three Uzroci i rješenja niske koncentracije RNK/lošeg kvaliteta
1. Prinos je prenizak
Ekstrahovani uzorak je prenizak, ukupna količina je nedovoljna ili je ekstrahovani uzorak previše i liza nije potpuna;tkivo ili ćelije odgovarajućeg kvaliteta treba koristiti za ekstrakciju, prethodna obrada uzorka mora biti dobro obavljena, a liza treba biti dovoljna.
2. Ostaci genoma
Kod ekstrakcije Trizol metodom, kada se supernatant uvuče u srednji sloj nakon nanošenja slojeva, doći će do ozbiljne kontaminacije genoma;potrebno je obratiti posebnu pažnju prilikom nanošenja slojeva kako bi se izbjeglo usisavanje u srednji sloj.Ako se za ekstrakciju koristi metoda kolone, za ekstrakciju se može odabrati komplet koji sadrži DNazu I.Nukleinska kiselina adsorbovana na membrani se direktno digestira sa DNazom I, što može u velikoj meri smanjiti ostatke DNK.
3. Razgradnja RNK
To može biti degradacija samog ekstrahovanog uzorka ili degradacija uzrokovana tokom procesa ekstrakcije;koliko god je to moguće, svježe uzorke treba koristiti za ekstrakciju RNK, a prikupljene uzorke treba na vrijeme čuvati u tečnom azotu ili frižideru na -80°C i izbjegavati ponovno zamrzavanje i odmrzavanje.U procesu ekstrakcije RNK treba koristiti vrhove bez RNaze/DNaze, epruvete za centrifugiranje i druge materijale.Proces ekstrakcije treba da bude što je brži.Ekstrahovanu RNK treba staviti u kutiju za led i čuvati na -80 na vreme.Ako ekstrahovanu RNK treba detektovati gel elektroforezom, elektroforezu treba izvesti odmah nakon ekstrakcije, a pufer za elektroforezu treba zameniti novopripremljenim.
4. Ostaci soli i organskog rastvarača
Reagensi za ekstrakciju sadrže fenol i gvanidinske soli, a otopina za pranje sadrži etanol.Tokom procesa ekstrakcije, lizat nije potpuno apsorbovan i odbačen, a rastvor za pranje nije u potpunosti osušen.Preostale soli i organski rastvarači su štetni za naknadnu reverznu transkripciju i PCR.Različiti stupnjevi inhibicije, tako da lizat tkiva treba u potpunosti ukloniti tokom procesa ekstrakcije, a ispiranje treba biti dovoljno da se okolni zidovi epruvete mogu oprati.Osim toga, cijev se prazni i duva je neophodan korak, koji će dodatno smanjiti ostatke organske tvari.
Za više informacija o ekstrakciji RNK pratite našu web stranicu:
www.foreivd.com za više informacija.
Vrijeme objave: 01.12.2022
