• facebook
  • linkedin
  • youtube

Tehnologija molekularne dijagnostike koristi metode molekularne biologije za otkrivanje ekspresije i strukture genetskog materijala ljudskog tijela i različitih patogena, kako bi se postigla svrha predviđanja i dijagnosticiranja bolesti.

Posljednjih godina, s nadogradnjom i iteracijom tehnologije molekularne dijagnostike, klinička primjena molekularne dijagnostike postaje sve opsežnija i produbljiva, a tržište molekularne dijagnostike je ušlo u period brzog razvoja.

Autor sumira uobičajene tehnologije molekularne dijagnostike na tržištu, a podijeljen je u tri dijela: prvi dio predstavlja PCR tehnologiju, drugi dio predstavlja tehnologiju izotermne amplifikacije nukleinske kiseline, a drugi dio tehnologiju sekvenciranja.

01

Dio I: PCR tehnologija

PCR tehnologija

PCR (lančana reakcija polimeraze) je jedna od tehnologija in vitro amplifikacije DNK, sa istorijom dugom više od 30 godina.

PCR tehnologiju je 1983. godine uveo Kary Mullis iz Cetusa, SAD.Mullis se prijavio za PCR patent 1985. godine i objavio prvi PCR akademski rad o nauci iste godine.Mullis je dobio Nobelovu nagradu za hemiju 1993.

Osnovni principi PCR-a

PCR može pojačati fragmente ciljne DNK više od milion puta.Princip je da se pod katalizom DNK polimeraze, roditeljski lanac DNK koristi kao šablon, a specifični prajmer se koristi kao početna tačka za produžavanje.Replicira se in vitro kroz korake kao što su denaturacija, žarenje i ekstenzija.Proces DNK kćeri lanca komplementaran matičnom lancu DNK šablona.

1

Standardni PCR proces podijeljen je u tri koraka:

1. Denaturacija: Koristite visoku temperaturu za razdvajanje dvostrukih lanaca DNK.Vodikove veze između dvostrukih lanaca DNK prekidaju se na visokim temperaturama (93-98°C).

2. Žarenje: Nakon što je dvolančana DNK odvojena, temperatura se snižava tako da se prajmer može vezati za jednolančanu DNK.

3. Produžetak: DNK polimeraza počinje sintetizirati komplementarne niti duž lanaca DNK od vezanih prajmera kada se temperatura spusti.Kada je proširenje završeno, ciklus je završen, a broj fragmenata DNK se udvostručuje.

Uzvraćanjem ova tri koraka 25-35 puta, broj fragmenata DNK će se eksponencijalno povećati.

2

Genijalnost PCR-a je u tome što se različiti prajmeri mogu dizajnirati za različite ciljne gene, tako da se fragmenti ciljnog gena mogu amplificirati u kratkom vremenskom periodu.

Do sada se PCR može podijeliti u tri kategorije, a to su obični PCR, fluorescentni kvantitativni PCR i digitalni PCR.

Prva generacija običnog PCR-a

Upotrijebite običan PCR instrument za amplifikaciju za amplifikaciju ciljnog gena, a zatim koristite elektroforezu u agaroznom gelu za detekciju proizvoda, može se napraviti samo kvalitativna analiza.

Glavni nedostaci prve generacije PCR-a:

-Sklon nespecifičnom pojačavanju i lažno pozitivnim rezultatima.

-Otkrivanje traje dugo i operacija je glomazna.

-Može se uraditi samo kvalitativno ispitivanje.

Kvantitativni fluorescentni PCR druge generacije

Fluorescentni kvantitativni PCR (PCR u realnom vremenu), također poznat kao qPCR, koristi se za praćenje akumulacije pojačanih proizvoda kroz akumulaciju fluorescentnih signala dodavanjem fluorescentnih sondi koje mogu ukazati na napredak reakcionog sistema, te za procjenu rezultata kroz krivu fluorescencije, a može se kvantificirati i standardnom krivom Cqq.

Budući da se qPCR tehnologija provodi u zatvorenom sistemu, vjerovatnoća kontaminacije je smanjena, a signal fluorescencije se može pratiti za kvantitativnu detekciju, tako da je u kliničkoj praksi najšire korištena i postala dominantna tehnologija u PCR-u.

Fluorescentne supstance koje se koriste u fluorescentnom kvantitativnom PCR-u u realnom vremenu mogu se podijeliti na: TaqMan fluorescentne sonde, molekularne svjetionike i fluorescentne boje.

1) TaqMan fluorescentna sonda:

Tokom PCR amplifikacije dodaje se specifična fluorescentna sonda uz dodavanje para prajmera.Sonda je oligonukleotid, a dva kraja su označena sa reporterskom fluorescentnom grupom i fluorescentnom grupom za gašenje.

Kada je sonda netaknuta, fluorescentni signal koji emituje reporterska grupa apsorbuje grupa za gašenje;tokom PCR amplifikacije, 5′-3′ egzonukleazna aktivnost enzima Taq cijepa i degradira sondu, čineći reportersku fluorescentnu grupu i gasitelj. scenski signal je potpuno sinhronizovan sa formiranjem PCR proizvoda.

2) SYBR fluorescentne boje:

U PCR reakcijskom sistemu dodaje se višak SYBR fluorescentne boje.Nakon što je SYBR fluorescentna boja nespecifično ugrađena u dvostruki lanac DNK, emituje fluorescentni signal.Molekul boje SYBR koji nije ugrađen u lanac neće emitovati nikakav fluorescentni signal, čime se osigurava fluorescentni signal. Povećanje PCR proizvoda je potpuno sinhronizovano sa povećanjem PCR proizvoda.SYBR se vezuje samo za dvolančanu DNK, tako da se krivulja topljenja može koristiti za određivanje da li je PCR reakcija specifična.

3 4

3) Molekularni signali

To je dvostruko obilježena oligonukleotidna sonda u obliku petlje koja formira strukturu ukosnice od oko 8 baza na 5 i 3 kraja.Sekvence nukleinskih kiselina na oba kraja su komplementarno uparene, što uzrokuje da fluorescentna grupa i grupa za gašenje budu čvrste.Zatvori, neće proizvoditi fluorescenciju.

5

Nakon što se PCR proizvod generira, tokom procesa žarenja, srednji dio molekularnog svjetionika se uparuje sa specifičnom sekvencom DNK, a fluorescentni gen se odvaja od gena za gašenje kako bi se proizvela fluorescencija.

6

Glavni nedostaci PCR druge generacije:

Osjetljivost još uvijek nedostaje, a detekcija uzoraka s malim brojem kopija nije tačna.

Postoji uticaj pozadinske vrednosti, a rezultat je podložan smetnjama.

Digitalni PCR treće generacije

Digitalni PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) izračunava broj kopija ciljne sekvence kroz detekciju krajnje tačke i može izvršiti tačnu apsolutnu kvantitativnu detekciju bez upotrebe internih kontrola i standardnih krivulja.

Digitalni PCR koristi detekciju krajnje tačke i ne zavisi od vrednosti Ct (prag ciklusa), tako da je digitalna PCR reakcija manje pogođena efikasnošću amplifikacije, a tolerancija na inhibitore PCR reakcije je poboljšana, sa visokom preciznošću i reproduktivnošću.

Zbog karakteristika visoke osjetljivosti i visoke tačnosti, inhibitori PCR reakcije ga ne ometaju lako i može postići pravu apsolutnu kvantifikaciju bez standardnih proizvoda, što je postalo žarište istraživanja i primjene.

Prema različitim oblicima reakcione jedinice, može se podijeliti na tri tipa: mikrofluidni, čip i kapljični sistem.


Vrijeme objave: Jul-08-2021