Direktni PCR je reakcija koja direktno koristi životinjska ili biljna tkiva za amplifikaciju bez ekstrakcije nukleinske kiseline.Na mnogo načina, direktni PCR radi kao obični PCR

Glavna razlika je prilagođeni pufer koji se koristi u direktnom PCR-u, uzorak se može direktno podvrgnuti PCR reakciji bez ekstrakcije nukleinske kiseline, ali postoje odgovarajući zahtjevi za toleranciju enzima i kompatibilnost pufera uključenog u direktnu PCR reakciju.

Iako postoji više ili manje PCR inhibitora u uobičajenim uzorcima, direktni PCR još uvijek može postići pouzdano pojačanje pod djelovanjem enzima i pufera.Tradicionalna PCR reakcija zahtijeva visokokvalitetnu nukleinsku kiselinu kao šablonu, koja može inhibirati nesmetan napredak PCR reakcije ako šablon sadrži proteine ​​i druge nečistoće.Direktni PCR je trenutno jedna od najpopularnijih tehnologija u području molekularne dijagnostike.

01 Direktni PCR izvorno je korišten za životinje i biljke

Najranija primjena direktnog PCR-a je u području životinja i biljaka, kao što su krv, tkivo i dlaka pacova, mačaka, pilića, zečeva, ovaca, goveda itd., listovi i sjemenke biljaka, itd., koji se koriste za proučavanje genotipizacije, transgenosti, detekcije plazmida, analize gena, analiza izvora DNK, identifikacija izvora i drugih polja, identifikacija vrsta.

Ova polja imaju neke zajedničke karakteristike, to jest, sadržaj ciljnog gena je relativno visok i ekstrakcija nukleinske kiseline je problematična, tako da direktni PCR ne samo da može uštedjeti vrijeme i imati mali utjecaj na rezultate, već i uštedjeti troškove.

Direktan PCR koji se koristi za detekciju patogena je stvar posljednjih godina, neki proizvođači PCR reagensa su uložili mnogo napora u tom smjeru kada su napravili inovaciju.Posebno u ovoj epidemiji COVID-19, na tržištu su se pojavili mnogi takvi proizvodi za detekciju, kao što je komplet za otkrivanje nukleinske kiseline SARS-CoV-2 (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) koji je istražio i razvio Foregene, koji koristi tehnologiju RT PCR u realnom vremenu (rRT-PCR) za kvalitativno detekciju SARS-CoV-2 nukleinske kiseline u SARS-CoV-2 uzorci briseva iz zuba.

Foregene je jedna od kompanija koja koristi Direct PCR tehnologiju, za detekciju normalnih ORF1ab, N, E ivarijanta nukleinske kiseline u ljudskim uzorcima nazofaringealnog ili orofaringealnog brisa kao što su SARS-CoV-2 B.1.1.7 loza (UK), B.1.351 loza (ZA), B.1.617 loza (IND) i P.1 linija (BR).

02  Reagensi potrebni za direktni PCR

Sample Lysate

Uzorak lizata možete sami konfigurirati ili kupiti.Razlika u sastavu različitih marki lizata učinit će sposobnost lizanja različitom, a onda će vrijeme lize biti malo drugačije.Na primjer, za pripremu uzoraka životinjskog tkiva općenito se preporučuje liza od 30 minuta ili preko noći, a otopina za lizu za viruse se kreće od 3-10 minuta.

PCR master mix

Preporučuje se upotreba DNK polimeraze sa vrućim startom kako bi se poboljšala specifična amplifikacija i povećala sposobnost amplifikacije.Jezgro direktnog PCR-a je visoko tolerantna polimeraza.

Eliminišite ili inhibirajte komponente u uzorku koje utiču na amplifikaciju DNK

Nakon što se uzorak obradi lizatom, oslobađaju se proteini, lipidi i drugi ćelijski ostaci, te tvari će inhibirati PCR reakciju.Stoga, direktni PCR zahtijeva dodavanje odgovarajućeg uklanjanja ili inhibitora kako bi se smanjio utjecaj ovih faktora.

03  Zbirka od pet tačaka znanja direktnog PCR-a

Prvo, Direct PCR tehnologija je direktna PCR tehnologija za različite biološke uzorke.Pod ovim tehničkim uslovima, nema potrebe za odvajanjem i ekstrahiranjem nukleinske kiseline, direktnom upotrebom uzorka tkiva kao objekta i dodavanjem ciljnih genskih prajmera za izvođenje PCR reakcije.

Drugo, Direct PCR tehnologija nije samo tradicionalna tehnologija amplifikacije DNK šablona, ​​već uključuje i PCR reverznu transkripciju RNA šablona.

Treće, Direct PCR tehnologija ne samo da direktno izvodi rutinske kvalitativne PCR reakcije na uzorcima tkiva, već uključuje i qPCR reakcije u realnom vremenu, što zahtijeva da sistem reakcije ima snažnu sposobnost anti-pozadinske fluorescencije, a endogena fluorescencija gasi antagonističku sposobnost.

Četvrto, uzorci ciljani direktnom PCR tehnologijom trebaju samo oslobađanje šablona nukleinskih kiselina, a ne uklanjaju proteine, polisaharide, ione soli, itd. koji ometaju PCR reakciju.Što zahtijeva da polimeraza nukleinske kiseline i PCR mješavina u reakcionom sistemu imaju odličnu otpornost i prilagodljivost kako bi se osigurala aktivnost enzima i tačnost replikacije u složenim uvjetima.

Peto, uzorak tkiva ciljanog direktnom PCR tehnologijom bez ikakvog tretmana obogaćivanja nukleinskom kiselinom i količina šablona je vrlo mala, što zahtijeva da reakcioni sistem ima izuzetno visoku osjetljivost i efikasnost amplifikacije.